微波-超聲波輔助改善黑蒜品質(zhì)的研究

劉袆帆，林映妤，張浣悠，李妍馥，肖更生，王琴

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州，510225)

黑蒜是對新鮮生蒜在高溫高濕環(huán)境下通過發(fā)酵得到的產(chǎn)品，即在既定環(huán)境中將蒜體本身破壞后，通過生蒜固有成分的理化反應(yīng)而產(chǎn)生的。在黑蒜加工過程中，熱處理會引起各種化學(xué)反應(yīng)，如酶促褐變和美拉德反應(yīng)，使大蒜的顏色從白色變?yōu)辄S色再變?yōu)樯詈稚：谒獾暮橇?、總酸含量以及多酚和類黃酮的含量均高于新鮮生蒜[1-2]。JUNG等[2]發(fā)現(xiàn)黑蒜比新鮮生蒜具有更強(qiáng)的抗氧化活性。此外，黑蒜中半胱氨酸(S-allylcysteine，SAC)的含量約是生蒜的5倍[3-4]。

傳統(tǒng)的黑蒜加工工藝相對簡單，但發(fā)酵時間長，一般為60～90 d，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品周期長。液態(tài)黑蒜的發(fā)酵還包括蒜瓣的預(yù)處理和后期真空包封等操作，其發(fā)酵時間為16～19 d[5]。雖然與傳統(tǒng)黑蒜發(fā)酵工藝相比，黑蒜的液態(tài)發(fā)酵時間大大縮短，但預(yù)處理繁瑣且工藝條件必須嚴(yán)格控制。與此同時，三段變溫恒濕發(fā)酵法也可用于制作黑蒜，該工藝發(fā)酵時間一般為41 d，比傳統(tǒng)發(fā)酵工藝時間短，發(fā)酵所得產(chǎn)品質(zhì)量好。鑒于這些優(yōu)點，本研究采用三段式變溫恒濕發(fā)酵法制備黑蒜。

近年來微波-超聲波輔助技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物有效成分提取，能夠加快細(xì)胞釋放多糖，提高多糖提取率。YU等[6]研究明確微波-超聲輔助技術(shù)下植物多糖的提取率比于自然浸出提高了6.67%。

本文以單頭大蒜和多瓣大蒜為原料，采用微波-超聲波輔助技術(shù)和三段變溫發(fā)酵法生產(chǎn)黑蒜。通過對加工過程中黑蒜品質(zhì)指標(biāo)的測定，建立品質(zhì)評價模型，為優(yōu)化和控制黑蒜加工過程中的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮新蒜，購自廣東省河源市本地農(nóng)貿(mào)市場。

超純水(Milli-Q系統(tǒng))，馬薩諸塞州比勒利卡市密理博公司；NaOH，中國北京百靈威科技有限公司；無水葡萄糖，中國上海博奧生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸，中國上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；其他有機(jī)、無機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-50CL恒溫恒濕箱，中國上海億恒科學(xué)儀器有限公司；CR-400比色計，日本美能達(dá)；GY-4硬度計，浙江拓普儀器公司;MesoMR23-040H-1低場核磁共振(LF-NMR)分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 樣品制備

選擇表皮微黃、斑點正常、無物理損傷或異常軟化且成熟度相同的新鮮大蒜鱗莖進(jìn)行加工。將鱗莖分為4組：單頭黑蒜實驗組(A)、多瓣黑蒜實驗組(B)、單頭黑蒜對照組(CA)和多瓣黑蒜對照組(CB)。各組按表1所示進(jìn)行處理。預(yù)處理后，將各組樣品放入恒溫恒濕箱中，并在指定溫度和濕度下進(jìn)行加工(第一階段：50～60 ℃，75～85%；第二階段：60～70 ℃，75～85%；第三階段：40～50 ℃，40～50%)。每天對加工后各組鱗莖的特性進(jìn)行評估。測量分3次進(jìn)行，同時進(jìn)行評估，直到各組鱗莖的食物價值呈最大化(與市面上出售的黑蒜相比較)。

表1 黑蒜的加工處理組Table 1 Processing treatments for the black garlics

1.4 理化性質(zhì)測定

1.4.1 色差分析

參考POEL等[7]的方法并稍作修改，通過評估每組的3個鱗莖來檢測色差。使用CR-400比色計在鱗莖的一致位置(從黑蒜體的外表面和黑蒜體凹線的內(nèi)表面選擇)評估表皮顏色。黑蒜樣品的顏色使用L*a*b*色度坐標(biāo)，以“a”為起始色度坐標(biāo)進(jìn)行定量測定，其中L*表示亮度，a*表示紅綠色，b*表示黃藍(lán)色。每組測定分3次進(jìn)行。

1.4.2 硬度分析

參考文獻(xiàn)[8]，將硬度計預(yù)熱10 min并設(shè)置為零數(shù)值，將硬度計平行放置在測量臺上，隨后選擇鱗莖上3個點，按照恒定速度按下手柄以讀取峰值，峰值讀數(shù)記錄即為硬度值，單位為kg/cm2。

1.4.3 還原糖分析

將5.00 g黑蒜于150.00 mL去離子水中攪拌均勻，隨后在60 ℃條件下不斷攪拌3 h。使用吸濾器過濾，3,5-二硝基水楊酸(DNS)方法計算還原糖含量[9]。使用雙光束紫外可見分光光度計監(jiān)測pH值，并在540 nm波長下讀取吸光度。大蒜溶液的還原糖含量按公式(1)計算。

(1)

式中：m，還原糖含量，mg/g；ρglucose solution，按吸光度值計算出的葡萄糖溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；N，物質(zhì)的量；mblack garlic，黑蒜樣品質(zhì)量，mg。

1.4.4 低場核磁共振分析

使用磁場強(qiáng)度為20.00 MHz的低場核磁共振分析儀進(jìn)行核磁共振測序， Carr-Purcell-Mei-Boom-Gill(CPMG)脈沖序列從32次重復(fù)掃描中獲得2 000次回波橫向馳豫數(shù)據(jù)(T2)。每次測序重復(fù)3次。

采用Multi-Exp-Inv分析軟件對CPMG的衰減曲線進(jìn)行分布指數(shù)擬合。利用軟件算法對弛豫數(shù)據(jù)進(jìn)行多指數(shù)擬合分析，得到單個弛豫過程的弛豫幅度與弛豫時間的關(guān)系曲線，從峰值位置計算出各過程的時間常數(shù)，同時峰下面積(相當(dāng)于水分子的弛豫時間峰面積)通過積分得出。此外，弛豫總體寬度計算作為給定峰值的觀察弛豫時間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.5 感官評價

選取10名專業(yè)人員對加工過程中不同時間的黑蒜樣品進(jìn)行感官評估。評估基于5個預(yù)先定義的特征(顏色、干燥度、質(zhì)地、氣味和味道)。得分范圍為0～20，其中0是最差的特征，20是最好的特征(表2)。將樣品冷卻至室溫，在測試前30 min準(zhǔn)備一小盤的樣品，隨后給每個小組成員取一茶匙量進(jìn)行感官評價。

表2 感官吸引力評分規(guī)則Table 2 Sensory appeal scoring rubric

1.4.6 統(tǒng)計分析

利用ANOVA進(jìn)行方差分析。通過Duncan多重極差或最小二乘差(LSD)檢驗數(shù)據(jù)中各項平均差(P<0.05)。采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計所有試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖

圖1顯示，在加工過程中隨著時間增加，黑蒜的還原糖含量不斷提高。從第6天開始，A組(圖1-c)的還原糖含量與CA組有顯著差異(P<0.05)，而B組(圖1-f)從第8天開始與CB組相比還原糖含量有顯著差異(P<0.05)。因此，微波-超聲波輔助預(yù)處理提高了黑蒜中還原糖的含量。加工至第三階段結(jié)束時，還原糖含量仍然很高，主要來源于蔗糖、葡萄糖和果糖，有可能是大蒜中多糖(如果聚糖和半乳糖)降解的產(chǎn)物。黑蒜中增加的還原糖(果糖和葡萄糖)含量分別促進(jìn)了酸味和甜味，賦予了黑蒜果味[10]。加工至第11天，黑蒜的顏色和味道都得到了顯著改善。由此推斷，美拉德反應(yīng)在第11天左右最為強(qiáng)烈。

圖1 黑蒜加工1(D1)、6(D6)、11(D11)和41(D41)d的LF-NMR T2弛豫時間分布a-單頭黑蒜實驗組;b-單頭黑蒜對照組;d-多瓣黑蒜實驗組;e-多瓣黑蒜對照組(每條線代表每個采樣時間的9條曲線的平均值,3個樣本中的每一個都有3個測量值)；c-單頭黑蒜加工過程中還原糖變化;f-多瓣黑蒜加工過程中還原糖含量的變化Fig.1 Distribution of LF-NMR T2 relaxations times in black garlic processed for 1(D1), 6(D6), 11(D11), and 41(D41) day*表示顯著差異(P<0.05)(下同)

2.2 色差數(shù)據(jù)分析

采用比色計對鱗莖的一致位置進(jìn)行測量，并通過色度坐標(biāo)記錄不同組的顏色參數(shù)。表3顯示了顏色參數(shù)(Δa、Δb、ΔL和ΔE)的平均值。O代表外表面，I代表內(nèi)表面。8組的亮度具有顯著差異性(P<0.05)。單頭黑蒜表皮在加工過程中亮度均下降，多瓣黑蒜表皮亮度先升高后降低(表3)，說明隨著加工時間延長，蒜瓣的亮度降低可能是褐變減少的結(jié)果。

加工第一、第二階段固有成分的美拉德反應(yīng)引起黑蒜褐變，加工第三階段進(jìn)行酶促褐變。黑蒜加工第二階段中美拉德反應(yīng)加快，類黑素等反應(yīng)產(chǎn)物迅速積累。AO、AI、CAO、CAI、BO、BI組蒜瓣表皮顏色亮度呈下降趨勢，CBO和CBI組蒜瓣表皮顏色亮度先升高后降低。實驗組褐變程度高于對照組，說明微波-超聲波輔助預(yù)處理對酶促反應(yīng)引起表皮顏色變化有影響。大蒜樣品的總色差(ΔE)隨著熱處理時間的延長而增大[11]。黑蒜樣品的褐變程度由加工時間的延長而增加，41 d后表皮呈黑褐色。

1)Δa代表紅色和綠色的色差，Δb代表藍(lán)色和黃色的色差，ΔL代表亮度差異, 其中正值表示蒜皮較明亮，負(fù)值表示蒜皮較暗.ΔE代表總色差, 差別越大，顏色變化越明顯

2)樣品:AO=單頭黑蒜實驗組外表皮, AI=單頭黑蒜實驗組內(nèi)表皮， CAO=單頭黑蒜對照組外表皮, CAI=單頭黑蒜對照組內(nèi)表皮, BO =多瓣黑蒜實驗組外表皮, BI=多瓣黑蒜實驗組內(nèi)表皮, CBO=多瓣黑蒜對照組外表皮, CBI =多瓣黑蒜對照組內(nèi)表皮

2.3 水分含量分析

利用低場核磁共振進(jìn)行核磁共振測序，并采用CPMG序列反演法測定樣品的橫向弛豫時間，其中樣品的積分面積(標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)子密度)與樣品中給定成分的含量成正比[12]。圖1顯示了黑蒜樣品在加工過程中CPMG弛豫衰減曲線，由于其他類型的水信號太弱而無法檢測，圖像中僅觀察到一種水類型，被定義為T2且指定為自由水[13]。隨著處理時間的延長，CPMG信號衰減變得緩慢，這說明在處理過程中水的流動性增加。如圖1-a、b、d、e所示，T2反演圖的波峰代表大蒜的水分狀態(tài)，對應(yīng)的峰積分面積為A2(T2的峰面積)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組處理前T2峰面積均小于加工后，說明鱗莖在加工過程中自由水含量降低。在高溫高濕條件下，黑蒜自由水含量降低，但黑蒜實驗組自由水含量高于對照組。由此合理推測微波-超聲波輔助預(yù)處理破壞了黑蒜的組織和細(xì)胞，促進(jìn)了自由水在高濕度環(huán)境中的進(jìn)出。

由于黑蒜中的自由水含量只受環(huán)境濕度和試驗條件的影響[14]。隨著加工時間的延長，T2弛豫時間逐漸縮短，這說明水的流動性降低，推測延長加工時間可以降低自由水的活性，并進(jìn)一步限制其自由度。

圖2顯示了黑蒜的核磁共振圖像。在加工的第一和第二階段，明亮區(qū)域從蒜瓣的外部到內(nèi)部逐漸增加，說明水正處于持續(xù)釋放狀態(tài)。在加工的第三階段，單頭黑蒜組的明亮區(qū)域再增加，而多瓣黑蒜對照組的明亮區(qū)域亮度正逐漸減弱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了CB組以外其他組的自由水均轉(zhuǎn)移到了蒜瓣表面。

圖2 加工過程中1, 6, 11和41 d的黑蒜外觀Fig.2 Appearance of black garlic processed for 1, 6, 11 and 41 d

2.4 感官評價

感官評價結(jié)果如圖3所示。B組和CB組樣品的干燥度隨著時間增長而迅速下降。單頭黑蒜組的味覺得分高于多瓣黑蒜組，其中實驗組樣品的味覺得分高于對照組。每組在加工第一階段的嗅覺評估中均高于15分；在加工的第二階段，樣品顏色得分均保持不變，單頭黑蒜組味覺得分增加，而干燥度得分相似，維持在10～15分。

a-1 d;b-6 d;c-11 d;d-41 dA-單頭黑蒜實驗組；CA-單頭黑蒜對照組;B-多瓣黑蒜實驗組;CB-多瓣黑蒜對照組圖3 黑蒜在加工過程中的T2加權(quán)圖像Fig.3 T2 weighted images of black garlic processed

結(jié)果顯示，在加工第41天，實驗組的干燥得分均高于15分，單頭黑蒜對照組的干燥得分在10～15分之間，多瓣黑蒜對照組的干燥得分在5～10分(圖3-e)。在加工41 d后，實驗組的5項感官得分均超過15分(圖3-e)，而對照組均低于15分，說明微波-超聲波輔助預(yù)處理操作能夠?qū)⒑谒獾募庸r間縮短至41 d。

2.5 黑蒜加工理化指標(biāo)的相關(guān)性研究

圖4顯示，A組和CA組理化指標(biāo)變化規(guī)律非常明顯(圖4-a)，說明黑蒜的品質(zhì)隨著三段發(fā)酵過程(第一階段：1～5 d，第二階段：6～9 d，第三階段：10～41 d)的進(jìn)行而變化。在第一、二段發(fā)酵期間，實驗組和對照組理化數(shù)據(jù)相對接近，而A組和CA組的理化性質(zhì)在第9天開始有了顯著差異。多瓣蒜B、CB組在三段發(fā)酵法試驗初期品質(zhì)變化與單頭蒜A、CA組差異顯著(圖4-b)，但理化數(shù)據(jù)無明顯變化。

a-單頭蒜品質(zhì)參數(shù)氣泡圖;b-和多瓣蒜品質(zhì)參數(shù)對比;c-黑蒜的自由水含量的箱式分析;d-顏色;e-氣味;f-口感圖4 黑蒜加工理化指標(biāo)Fig.4 Physicochemical indexes during black garlic processing

在三段發(fā)酵過程中，不同階段的黑蒜品質(zhì)不同。發(fā)酵第一階段中，實驗組與對照組的水分含量相似，而發(fā)酵第二階段A組的水分含量明顯高于CA組。B組水分含量也高于CB組，兩組間差異不顯著。發(fā)酵第三階段與前兩個階段相比(圖4-c)，各組的水分含量顯著降低。第1～8天，4組大蒜外觀色澤得分較低，蒜體呈白色或黃褐色。第9～12天，A組和CA組的物理性質(zhì)數(shù)據(jù)相對集中且較高， B組和CB組的物理性質(zhì)數(shù)據(jù)相對較低。A組在發(fā)酵第三階段中數(shù)據(jù)相對集中穩(wěn)定，與CA組相似。B組和CB組數(shù)據(jù)也相似，但由于樣品個體差異，數(shù)據(jù)分布并不集中(圖4-d)。在嗅覺方面，第一階段各組得分有顯著差異，數(shù)據(jù)不集中，但總體呈上升趨勢；第二階段，A組的氣味數(shù)據(jù)比CA組更集中且更高，而B組的氣味數(shù)據(jù)高于CB組；第三階段，4組氣味數(shù)據(jù)波動較大，分布不集中(圖4-e)。在口感方面(圖3-f)，3個階段各組數(shù)據(jù)相對集中，A組味道得分高于CA組，B組得分高于CB組，可見黑蒜實驗組的感官品質(zhì)優(yōu)于對照組。

從圖5-a可以看出，水分含量與黑蒜干燥度關(guān)系最為密切，與其他指標(biāo)關(guān)系不大。還原糖含量與氣味、味道和顏色3個方面密切相關(guān)，其次與大蒜質(zhì)地有關(guān)。從圖5-b可以看出，影響黑蒜味道的最大因素是顏色，其次是鱗莖質(zhì)地、還原糖含量和氣味(圖5-b1)。除硬度外，其他指標(biāo)與氣味有關(guān)且比例相似(圖5-b2)。影響黑蒜顏色相關(guān)系數(shù)最大的是味道與還原糖含量，其次與質(zhì)地、水分含量與氣味等方面有關(guān)，與干燥度和硬度無關(guān)(圖5-b3)。鱗莖質(zhì)地與味道、色澤、還原糖含量、氣味這4個因素呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.45、0.49、0.28和0.25(圖4-c)。味道與顏色(0.66)、還原糖含量(0.37)、氣味(0.24)呈正相關(guān)；顏色與還原糖含量(0.58)和氣味(0.26)呈正相關(guān)；還原糖含量與氣味(0.30)呈正相關(guān)。氣味與干燥度呈負(fù)相關(guān)(-0.26)。此外，水分含量與氣味(-0.21)、還原糖含量(-0.37)、顏色(-0.27)和鱗莖質(zhì)地(-0.16)呈負(fù)相關(guān)。

Venn圖結(jié)果顯示，17的數(shù)據(jù)可以直接使用單頭蒜的化學(xué)性質(zhì)表示(圖6-a)，只有10的數(shù)據(jù)可以使用多瓣蒜的化學(xué)性質(zhì)表示(圖6-b)，推測單頭蒜的顏色與其化學(xué)性質(zhì)有較高的相關(guān)性。

a-聚類熱圖分析;b-弦圖分析;b1-味道串圖分析;b2-氣味串圖分析;b3-顏色串圖分析;c-黑蒜品質(zhì)參數(shù)相關(guān)系數(shù)圖圖5 黑蒜品質(zhì)參數(shù)的圖形分析Fig.5 Graphic analysis of quality parameters of black garlic

a-單頭黑蒜化學(xué)特性及其色澤Venn圖;b-多瓣黑蒜化學(xué)特性;c-單頭黑蒜的NMDS分析;d-多瓣黑蒜NMDS分析;e-味覺品質(zhì)評價模型;f-氣味品質(zhì)評價模型圖6 黑蒜的化學(xué)性質(zhì)Fig.6 Chemical quality of black garlic

采用非計量多維標(biāo)度分析(NMDS)對黑蒜的化學(xué)性質(zhì)和色澤進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)單頭蒜的化學(xué)性質(zhì)在整個發(fā)酵過程中呈規(guī)律性變化。從散點圖(圖6-c)結(jié)果可見，三段發(fā)酵工藝提高了單頭黑蒜的品質(zhì)。多瓣蒜在發(fā)酵過程中數(shù)據(jù)變化不明顯，數(shù)據(jù)分布分散(圖6-d)，差異明顯。

在此基礎(chǔ)上，本文建立了2種黑蒜品質(zhì)分級模型。首先，我們建立了黑蒜味覺品質(zhì)分級模型(見圖5-e)。最為相關(guān)的因素是大蒜內(nèi)部顏色的亮度(LI)。當(dāng)LI>32.09時，評定為低質(zhì)量；當(dāng)LI≤32.09時，需要考察次要相關(guān)因素硬度(Hn)(表4)。

表4 黑蒜樣品(n=3)的硬度 單位：g

當(dāng)Hn≤5.37時，為中等硬度；Hn>5.37時，為高硬度。第二個模型(見圖5-f)與黑蒜氣味有關(guān)，與前一個模型類似，與黑蒜味道最相關(guān)的因素是LI。當(dāng)LI≤32.09時，黑蒜為優(yōu)質(zhì)；當(dāng)LI>32.09時，需考察水分活度的次要相關(guān)因子(由核磁共振成像后峰面積確定)；當(dāng)FW>10 171.91時，黑蒜為中等品質(zhì)；當(dāng)FW≤10 171.91時，為劣質(zhì)大蒜。

3 總結(jié)與討論

為改善黑蒜品質(zhì)，本文以單頭大蒜和多瓣大蒜為原料，采用微波-超聲波輔助技術(shù)預(yù)處理和三段發(fā)酵工藝進(jìn)行加工得到單頭黑蒜以及多瓣黑蒜。結(jié)果顯示，在加工制成黑蒜的過程中，熱處理會引起各種化學(xué)反應(yīng)，如酶促褐變和美拉德反應(yīng)，使大蒜的顏色從白色變?yōu)辄S色再變?yōu)樯詈稚?。采用比色計及L*a*b*色度坐標(biāo)進(jìn)行定量測定，發(fā)現(xiàn)黑蒜樣品的褐變速率在加工第二階段最快，第三階段最慢，且黑蒜實驗組的褐變程度高于對照組。通過CPMG馳豫衰減曲線分析發(fā)現(xiàn)黑蒜樣品自由水含量隨著加工時間的增長而降低。感官評價雷達(dá)圖結(jié)果顯示，加工41 d后黑蒜品質(zhì)達(dá)到最佳，黑蒜實驗組的感官品質(zhì)明顯優(yōu)于對照組，說明微波-超聲波輔助技術(shù)不僅縮短了加工時間，對黑蒜品質(zhì)也有較大提高。

結(jié)合黑蒜品質(zhì)與水分變化、硬度、色差、還原糖含量及感官評價等方面的相關(guān)性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三段發(fā)酵工藝提高了單頭黑蒜品質(zhì)，但對多瓣黑蒜品質(zhì)影響不大。通過熱圖、不同性質(zhì)相關(guān)串圖以及NMDS綜合評價了黑蒜不同性質(zhì)的相關(guān)性，其中黑蒜顏色與味道相關(guān)性系數(shù)達(dá)0.66，并還原糖含量和氣味都呈極強(qiáng)正相關(guān)，由此推測黑蒜性狀與其化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。YOU等[15]比較了4種不同類型的黑蒜，發(fā)現(xiàn)已發(fā)酵且陳化的黑蒜還原糖含量為25.90%，總酚含量為0.72 mg/mL，兩者均高于其他3種黑蒜，其抗氧化能力也顯著高于其他3種黑蒜。HYEON等[16]概述了黑蒜的理化性質(zhì)和功能活性，表明黑蒜在陳化過程中總酚、總糖、類黃酮含量增加，從而提高了黑蒜的抗氧化活性。

最后根據(jù)上述結(jié)果以LI為主要因素建立簡單品質(zhì)評定模型參數(shù)間相關(guān)關(guān)系，為改善黑蒜品質(zhì)，提高黑蒜生產(chǎn)速度提供依據(jù)。今后的工作重點是將品質(zhì)與功能活動相結(jié)合，建立更全面的黑蒜品質(zhì)評價模型。