許 艷（綜述），施寶民（審校）

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 200065

1 背景

1967年，Loewenstein 等［1］用大鼠肝臟做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，大鼠肝癌細(xì)胞之間不能進(jìn)行離子交換，與同時(shí)期提出的細(xì)胞之間直接交流的喪失是癌癥發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)［2］這一學(xué)說不謀而合；同年，Revel 等［3］運(yùn)用負(fù)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞膜上的細(xì)胞之間的連接——日后命名為縫隙連接通道的六聚體亞基序列；直到1974年，Goodenough 等［4］成功分離小鼠肝臟中的2種縫隙連接蛋白質(zhì)并命名為縫隙連接蛋白（connexin，Cx）。20 世紀(jì)80年代中期，克隆出人和大鼠肝臟連接蛋白才是廣泛的縫隙連接通道研究的開端。

Cx 是一種細(xì)胞膜表面的四次跨膜蛋白，根據(jù)其分子量區(qū)分不同種類，目前在鼠類發(fā)現(xiàn)20 種Cx 而在人類發(fā)現(xiàn)21 種Cx 蛋白成員［5-6］。Cx 表達(dá)于脊椎動(dòng)物除紅細(xì)胞、成熟精子細(xì)胞和分化骨骼肌細(xì)胞的幾乎所有的細(xì)胞類型中，一般來說Cx的表達(dá)具有一定的種屬特異性及器官特異性。所有的連接蛋白有著相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［7］，包括1個(gè)N 末端，4個(gè)跨膜區(qū)（M1-M4），2個(gè)胞外環(huán)（Extracellular loop），1個(gè)胞內(nèi)環(huán)（cytoplasmic loop），1個(gè)C 末端（圖1），4個(gè)跨膜區(qū)的氨基酸序列在不同的縫隙連接蛋白中高度保守，同源性較高。6個(gè)蛋白質(zhì)分子作為亞單位組成六聚體稱為連接子而整合到細(xì)胞膜上，相鄰細(xì)胞膜之間同樣的連接子對接形成的細(xì)胞間通道稱為縫隙連接（gap junction，GJ）［8］。

圖1 縫隙連接蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of connexin

連接子是中空的圓筒狀親水性通道，其中心直徑約為1.5～2.0 nm，可以允許分子量少于1 000 道爾頓的小分子通過，如水、離子、ATP、IP3、小分子肽、第二信使等，因此可以快速協(xié)同相鄰細(xì)胞對外界信號的反應(yīng)，GJ 介導(dǎo)小分子物質(zhì)在細(xì)胞間的流動(dòng)引起信號改變，又為縫隙連接細(xì)胞間通訊（GJIC）作用［9-10］。細(xì)胞膜電位與細(xì)胞內(nèi)酸堿度變化，以及胞液游離鈣離子濃度的改變可以影響縫隙連接通道的開放及關(guān)閉［11］。

GJ 作為一種細(xì)胞與細(xì)胞之間聯(lián)系的方式，長期以來認(rèn)為其在細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖、凋亡及分化過程中起主導(dǎo)作用，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、整個(gè)器官功能及新陳代謝起重要的調(diào)控作用［12］。但除了被視為GJ 的重要組成而執(zhí)行作為通道的功能之外，如今越來越明確Cx 還有除GJIC 之外的半通道作用和作為功能蛋白質(zhì)的作用［13］，其在病理狀態(tài)、腫瘤生長、遷移及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面扮演更重要的角色［14］。

2 Cx32與肝臟穩(wěn)態(tài)

肝臟中表達(dá)豐富的縫隙連接蛋白，在縫隙連接蛋白的基因序列與蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)以前，用電鏡例如冰凍蝕刻電鏡已觀察到肝臟細(xì)胞中含有豐富的縫隙連接超級顯微結(jié)構(gòu)，故肝臟被當(dāng)作最常用的研究縫隙連接的組織。肝臟組織中（不包括支配肝臟的血管組織，血管組織的特征性縫隙連接蛋白為Cx37、Cx40 與Cx43）存在至少4 種縫隙連接蛋白：Cx26、Cx32、Cx40 與Cx43，隨著肝臟發(fā)育成熟，Cx32成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)的連接蛋白并且在肝臟功能穩(wěn)態(tài)中起主導(dǎo)作用［15］。隨著20 世紀(jì)70年代的細(xì)胞組織化學(xué)與單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，David Paul，Kumar Gilula 等［16-17］研究組在1986年首先從肝臟組織中克隆了大鼠的Cx32。

2.1 Cx32與肝臟生長發(fā)育

Cx32參與肝臟功能穩(wěn)態(tài)維持的機(jī)制中，其GJIC作用得到較多研究者的關(guān)注，建立精細(xì)的肝細(xì)胞的GJIC 對于正常的肝臟發(fā)育非常重要。由于肝切除后再生模型中GJIC 的削弱使得研究者一度認(rèn)為GJIC 在控制肝細(xì)胞分裂增殖中扮演重要角色［18］，隨著Cx32 的鑒定及基因技術(shù)的應(yīng)用，現(xiàn)在更多認(rèn)為GJIC并不涉及細(xì)胞周期中G0/1-S轉(zhuǎn)變，也不促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展［19］，Cx32介導(dǎo)的GJIC不具備促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖作用［20］。但公認(rèn)其對于維持肝細(xì)胞分化成熟至關(guān)重要，胚胎型肝細(xì)胞主要表達(dá)Cx43，或者說Cx43是干細(xì)胞的特征性縫隙連接［21］，在肝祖細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化過程中Cx43 逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镃x26 及Cx32，Cx32 占主導(dǎo)優(yōu)勢并達(dá)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的90%，Cx26 主要分布于門靜脈周圍的組織，更多證據(jù)還是支持在成人的肝臟維持功能分化如糖原分解、氨解毒、白蛋白分泌、生物轉(zhuǎn)換等方面主要還是Cx32 起著關(guān)鍵作用［22］。

原代肝細(xì)胞來源受限、體外增殖難以為繼使得通過誘導(dǎo)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成為研究熱點(diǎn)，但是實(shí)際操作中由干細(xì)胞分化而來的肝細(xì)胞總是有著胎兒肝細(xì)胞的表型及功能，使得該分化過程中走向著成熟肝細(xì)胞的最后一步成為困境［23］。在肝細(xì)胞再生領(lǐng)域，Cx32 也扮演著重要的角色，不論是通過基因還是化學(xué)藥物增強(qiáng)Cx32 的表達(dá)都可以促進(jìn)肝細(xì)胞分化，反之亦然，Qin 等［24］首次證明了Cx32 作為一種關(guān)鍵的肝縫隙連接蛋白，調(diào)節(jié)人胚胎干細(xì)胞（hESC）向肝譜系的分化和成熟，其結(jié)果表明Cx32及其GJIC 活動(dòng)的上調(diào)可以促進(jìn)肝細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)及分化過程中肝細(xì)胞功能的提升，后又有學(xué)者且進(jìn)一步提出這一過程可以由p38 MAPK 信號通路調(diào)節(jié)，p38抑制劑可以通過上調(diào)Cx32及下調(diào)Cx43表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞分化［25］，而p38 MAPK 通路通過磷酸化降解Cx32，負(fù)調(diào)控Cx32 及其介導(dǎo)的縫隙連接可削弱GJIC功能。

近年來人們初識縫隙連接通道與細(xì)胞凋亡相關(guān)性，但這一研究處于初始階段，與肝細(xì)胞相關(guān)的研究更為稀少，Cx32 與肝細(xì)胞凋亡的研究尚未見報(bào)道。已有研究用肝癌細(xì)胞細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)凋亡早期出現(xiàn)GJIC 的瞬時(shí)性增強(qiáng)［26］，可能表明縫隙連接通道在細(xì)胞間凋亡初期有死亡信號傳播的作用，鈣離子為其關(guān)鍵。隨后而來的則是GJIC 活動(dòng)的削弱，可能是為了阻止有毒代謝物如一氧化氮及超氧陰離子與周圍健康細(xì)胞的物質(zhì)交換［27-28］。細(xì)胞凋亡過程中GJIC 的消失是由于縫隙連接的去除，而不是由于它們的功能關(guān)閉，而觀察肝細(xì)胞凋亡后期Cx32合成增加且在細(xì)胞膜表面聚合成半通道形態(tài)，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Cx32半通道促進(jìn)細(xì)胞凋亡向壞死轉(zhuǎn)變［29］，但目前此研究領(lǐng)域尚顯空白。

2.2 Cx32與肝臟病理過程

肝臟病理狀態(tài)如中毒、損傷、炎癥和氧化應(yīng)激期間往往伴隨著Cx32和Cx26的表達(dá)降低和Cx43表達(dá)增加［30］。通常認(rèn)為Cx32 對于肝臟穩(wěn)態(tài)起著保護(hù)性作用，但各個(gè)研究結(jié)論對于Cx32在肝臟功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用大相徑庭。

一方面，研究顯示在藥物誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型中，認(rèn)為與野生型動(dòng)物相比，Cx32基因陰性變異者受到損傷時(shí)表現(xiàn)為更明顯的肝臟損傷、炎癥和氧化應(yīng)激［31］。Cx32 陰性變異者僅僅阻斷其GJIC 功能而不干擾非GJIC 功能，提示Cx32 的GJIC 在非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展中起保護(hù)性作用［32］。Cx32 基因敲除的小鼠在由對乙酰氨基酚引發(fā)的肝損傷中表現(xiàn)更為嚴(yán)重［33］，在四氯化碳誘導(dǎo)建立的肝纖維化模型中，Cx32 基因敲除小鼠表現(xiàn)為更重的肝損傷和更多地膠原沉積［34］，進(jìn)一步認(rèn)為基于Cx32信號調(diào)節(jié)抗氧化能力可抵抗肝損害。

另一方面，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cx32缺陷小鼠在藥物性肝損的進(jìn)程中受到保護(hù)，簡單的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示Cx32抑制劑2-氨基乙氧基硼酸二苯酯抑制Cx32 介導(dǎo)的GJIC，應(yīng)用于野生基因型小鼠可以減輕藥物誘導(dǎo)的肝損傷［35］，Cx32 陰性變異轉(zhuǎn)基因大鼠對四氯化碳、半乳糖胺等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝損傷具有抵抗力［36］，提示肝細(xì)胞之間的縫隙連接在組成分子通道介導(dǎo)GJIC 同時(shí)也可介導(dǎo)化學(xué)藥物的毒理效應(yīng)、有害信號通過GJ在細(xì)胞之間傳遞，促進(jìn)肝臟損傷、炎癥擴(kuò)大。而不僅僅是扮演保護(hù)細(xì)胞的角色。另外對乙酰氨基酚引起急性肝中毒的模型中，在Cx32陰性變異轉(zhuǎn)基因大鼠受到的肝毒性遠(yuǎn)小于野生型，且提出Cx32形成的GJIC 變化引發(fā)第二信使如ATP、鈣離子的改變，從而誘導(dǎo)Cx43 生成，在乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的過程中則主要是通過Cx43介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［37］。

因?yàn)楦鱾€(gè)實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物模型不具有同質(zhì)性，藥物使用亦不統(tǒng)一，因此尚沒有權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室能證實(shí)Cx32 在肝臟毒性損傷過程中起何種作用，Cx32基因敲除的動(dòng)物模型并沒有辦法區(qū)分藥物誘導(dǎo)的肝損傷是基于GJIC 還是非GJIC 信號改變而引起的，Cx32 的半通道作用介導(dǎo)的是細(xì)胞與其周圍細(xì)胞外環(huán)境之間的信號傳遞，不同于GJIC，半通道更傾向于在病理狀態(tài)時(shí)起作用，且發(fā)現(xiàn)它在原代肝細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞死亡［38］。

2.3 Cx32與肝癌發(fā)生

在細(xì)胞癌變方面，人們視Cx32 基因?yàn)橐职┗?，但在癌變過程，GJIC 丟失的許多機(jī)制中，涉及連接蛋白基因的變異卻是罕見事件，更常見的是表觀遺傳修飾如DNA 甲基化［22］。除了在維持肝細(xì)胞正常表型、提升肝細(xì)胞特異性功能的作用外，Cx32 可降低惡性表型，對腫瘤形成機(jī)制有抑制效應(yīng)，轉(zhuǎn)染Cx32cDNA 抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長，而Cx32 會(huì)減少者發(fā)生肝癌的概率極大增加［39-41］。而Cx32 基因敲除小鼠肝臟極易發(fā)生癌變，或者在致癌物誘導(dǎo)下更易出現(xiàn)肝癌［42-44］。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是多種腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制，Cx32是肝癌EMT的重要調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)染Cx32cDNA 可逆轉(zhuǎn)EMT，部分恢復(fù)肝細(xì)胞癌對奧沙利鉑的敏感性［45］，因此Cx32有望成為逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的新靶點(diǎn)。

盡管最初Cx32 相關(guān)的GJIC 被視為腫瘤抑制因子，但現(xiàn)今越來越多研究表明連接蛋白的狀態(tài)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著復(fù)雜的關(guān)系，介導(dǎo)不同的信號通路則引起不同的效應(yīng)，從調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附和遷移角度來說，不如將其歸類為條件性腫瘤抑制因子［46］。在肝細(xì)胞癌中，盡管檢測到Cx32蛋白表達(dá)增加，但因其定位于細(xì)胞質(zhì)中，可增進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移而加快疾病進(jìn)程［47］。此外，體內(nèi)模型證明在誘導(dǎo)表達(dá)的Cx32 不能形成GJIC 通道和半通道時(shí)可促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，小鼠中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶明顯增加［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Cx32的上調(diào)及胞質(zhì)定位與該腫瘤的TNM分期、分化及預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步地揭示其以獨(dú)立于GJIC 的機(jī)制保護(hù)肝癌細(xì)胞使其免于化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，該機(jī)制為聯(lián)合酪氨酸激酶Src 激活EGFR 通路，建立在Cx32作為蛋白質(zhì)的功能上而非其介導(dǎo)的GJIC，因此Cx32可能會(huì)成為肝癌臨床預(yù)后的標(biāo)志物［48］。

3 結(jié)語

Cx 基因家族的復(fù)雜性及其亞型的特異性與人類許多疾病相關(guān)，從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾及運(yùn)輸至細(xì)胞膜方面闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制對于我們理解Cx在健康與疾病進(jìn)程中所起做作用很重要。以前的報(bào)道表明某些縫隙連接蛋白由于不是定位于細(xì)胞膜上而對細(xì)胞間通信沒有作用，Cx 需要運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜并正確組裝成間隙連接斑塊以形成功能性的間隙連接通道，因此，在肝臟發(fā)生病理生理改變過程中檢查功能性GJIC 的變化可能比單純觀察其蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化更為重要。但除GJIC 外，Cx形成半通道、其本身作為蛋白質(zhì)的非通道功能在許多病理生理過程也有其獨(dú)特的效應(yīng)，主要是通過與不同信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用而改變細(xì)胞的生物學(xué)行為，由此不難理解Cx在肝臟病理生理進(jìn)程中顯示出多種功能，而這些功能有時(shí)自相矛盾。目前研究多集中在Cx 介導(dǎo)的GJIC 作用上，但這些也只是揭示了冰山一角，未來仍然需要進(jìn)一步研究更多GJIC 及非GJIC 功能的分子機(jī)制及信號通路。尤其是在肝癌發(fā)生發(fā)展方面明確其作用機(jī)制找到靶點(diǎn)并施以藥物阻斷有望為肝癌診治開辟新的道路。