miR-21和miR-146a在癲癇患者中的表達(dá)及臨床意義

黃忠，曾義，王曦，趙戈

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科較為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率近年來呈逐步上升趨勢，以腦部神經(jīng)元放電異常所致的短暫且反復(fù)的神經(jīng)中樞功能失常為主要臨床特征[1]。癲癇發(fā)作對患者的身體和精神均會造成嚴(yán)重影響，癲癇長期和反復(fù)發(fā)作容易對中樞神經(jīng)造成損傷，具有一定致殘率和病死率，給患者的日常生活造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[2]。引起癲癇的病因較為復(fù)雜，如遺傳因素、腦部疾病和系統(tǒng)性疾病均可能引起癲癇發(fā)生，目前缺乏有效的臨床治療手段[3]。研究顯示，在癲癇發(fā)作過程中部分微小RNA(miRNA，miR)表達(dá)異常，可以作為癲癇診斷和預(yù)后預(yù)測的生物學(xué)標(biāo)志物[4]。miR是一類長度為20～24個堿基的短鏈RNA，不編碼蛋白質(zhì)，在體內(nèi)廣泛分布，參與細(xì)胞增殖、分裂和分化等一系列生物學(xué)過程[5]。miR-21與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)，參與腦部炎性反應(yīng)，其表達(dá)量升高會促進(jìn)缺血性腦卒中和神經(jīng)損傷的發(fā)生[6-7]。miR-146a同樣參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病過程，與星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常相關(guān)，參與唐氏綜合征和阿爾茨海默癥的發(fā)病過程[8-9]。 現(xiàn)分析癲癇患者血清miR-21和miR-146a表達(dá)水平及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年4月—2019年5月成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院/成都市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的癲癇患者99例作為癲癇組，選擇同期醫(yī)院健康體檢者99例作為健康對照組。健康對照組男51例，女48例，年齡24～68(48.25±16.73)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18.8～22.9(21.42±1.32) kg/m2。癲癇組男55例，女44例，年齡25～70(50.14±18.26)歲；病程1～12(6.74±1.96)年；BMI 18.5～22.1(20.77±1.08)kg/m2；癲癇類型：單純部分性癲癇發(fā)作45例，復(fù)雜部分性癲癇發(fā)作21例，繼發(fā)性癲癇全面發(fā)作33例；癲癇嚴(yán)重程度量表(NHS3)[10]評分11～21(16.05±4.46)分；吸煙史48例，酗酒史39例；高血壓史49例，糖尿病史22例，高脂血癥史5例，冠心病史1例。2組性別、年齡及BMI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2017年國際抗癲癇聯(lián)盟制定的癲癇發(fā)作診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：有>2次非誘發(fā)性或非反射性癲癇發(fā)作，且間隔>24 h；患者已發(fā)生1次非誘發(fā)性或非反射性癲癇發(fā)作，且患者在未來10年內(nèi)癲癇復(fù)發(fā)風(fēng)險與2次非誘發(fā)性或非反射性癲癇發(fā)作后復(fù)發(fā)風(fēng)險相當(dāng)，符合以上任意1條即可確診；②經(jīng)腦電圖及頭部CT和MR檢查診斷；③年齡>18歲；④入院前6個月內(nèi)未接受過相應(yīng)抗炎治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤患者；②存在腦部手術(shù)史者；③存在全身性感染性疾病；④存在自身免疫性疾病；⑤存在藥物依賴性疾?。虎薮嬖诰裾系K性疾病。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-21和miR-146a表達(dá)量檢測：采用熒光定量PCR儀(美國ABI科技有限公司生產(chǎn)，型號：ABI5800)檢測。患者入院翌日晨/健康對照組體檢當(dāng)日采集空腹肘靜脈血5 ml，高速離心機(jī)(湖南湘儀科技有限公司生產(chǎn)，型號：H1650)5 000 r/min離心30 min后吸取上清液待檢測，離心半徑12.5 cm。采用mirVana miRNA分離試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn))提取血清miRNA，使用miRNA cDNA合成試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)對提取獲得的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系：miRNA 5 μl，反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μl，10×miRNA反轉(zhuǎn)錄引物2 μl，水8 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、60 min，95 ℃、5 min。使用mirVana qRT-PCR miRNA檢測試劑盒對cDNA進(jìn)行定量檢測，反應(yīng)體系25 μl，包括水16.5 μl，5×PCR buffer 5 μl，50×ROX溶液0.5 μl，DNA聚合酶1 μl，PCR上游引物1 μl，PCR下游引物1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，進(jìn)行35個循環(huán)。miR-21上游引物序列：5’-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。 miR-146a上游引物序列：5’-TGCGCTGAGAACTGAATTACCAT-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，以U6基因作為內(nèi)參基因，U6上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物序列：5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’。根據(jù)2-△△Ct法計算miR-21和miR-146a的相對表達(dá)量。

1.3.2 血清TNF-α和IL-6水平檢測：使用TNF-α檢測試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司生產(chǎn))及IL-6檢測試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司生產(chǎn))，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TNF-α和IL-6水平，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清miR-21、miR-146a表達(dá)和炎性因子水平比較 癲癇組血清miR-21、miR-146a表達(dá)水平和血清TNF-α、IL-6水平明顯高于健康對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 2組受試者血清miR-21、miR-146a表達(dá)水平和炎性因子水平比較

2.2 血清miR-21、miR-146a表達(dá)與血清TNF-α、IL-6水平及NHS3評分相關(guān)性分析 血清miR-21與NHS3評分表達(dá)呈高度正相關(guān)(P<0.01)，而與IL-6和TNF-α呈中度正相關(guān)(P<0.01)。血清miR-146a與血清TNF-α和NHS3評分均呈中度正相關(guān)(均P<0.01)，而與IL-6呈弱正相關(guān)(P<0.01)，見表2。

表2 血清miR-21和miR-146a表達(dá)與血清TNF-α和IL-6水平及NHS3評分相關(guān)性分析

2.3 血清miR-21和miR-146a表達(dá)水平診斷癲癇價值分析 采用ROC曲線下面積(AUC)評估血清miR-21、miR-146a及二者聯(lián)合診斷癲癇的價值，結(jié)果顯示，miR-21、miR-146a及二者聯(lián)合診斷癲癇的AUC分別為0.760、0.793、0.884，見表3、圖1。

3 討 論

神經(jīng)元放電活動異常與基因遺傳、免疫系統(tǒng)紊亂和病毒性感染等因素相關(guān)，神經(jīng)元的放電異常是導(dǎo)致癲癇發(fā)作的主要因素[12]。對于年齡在35歲以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變患者癲癇發(fā)病率明顯升高，為普通人群的3～5倍[13]。臨床研究顯示，目前的癲癇治療臨床有效率低于45%，并且停止治療后有較高的復(fù)發(fā)率，嚴(yán)重影響患者的日常生活。傳統(tǒng)的臨床診斷方式往往更依賴醫(yī)生的個人經(jīng)驗，且癲癇的癥狀與暈厥有著高度相似性，不易區(qū)分，血清miR的檢測具有可重復(fù)性強(qiáng)、周期較短、不過于依賴個人經(jīng)驗的優(yōu)點，因此對癲癇發(fā)作過程中涉及到的相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行系統(tǒng)研究有助于癲癇的治療和診斷，為癲癇的靶向治療及診斷提供新的生物標(biāo)志物靶點及診療策略[14]。

圖1 血清miR-21和miR-146a診斷癲癇的ROC曲線

在腫瘤發(fā)病及心腦血管疾病發(fā)生過程中miRNA均起到重要的調(diào)節(jié)作用，miRNA通過與基因的信使RNA(mRNA)結(jié)合促進(jìn)mRNA降解，使得基因轉(zhuǎn)錄水平下降，進(jìn)而影響基因的翻譯，引起基因編碼蛋白質(zhì)水平的下降，影響相應(yīng)信號通路的活化，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[15]。癲癇發(fā)病過程中能夠觀察到患者星形膠質(zhì)細(xì)胞體積增大，胞漿肥大，細(xì)胞核縮小并且偏位，星形膠質(zhì)細(xì)胞存在發(fā)育異常[16]。在生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌神經(jīng)因子至胞外，作用于神經(jīng)元并對神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。而在病理條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞之間產(chǎn)生較強(qiáng)的縫隙連接，并形成相應(yīng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)?？p隙連接的增強(qiáng)會促進(jìn)神經(jīng)元的同步化放電，而同步化放電是造成驚厥的生理基礎(chǔ)，因此縫隙連接的增強(qiáng)會導(dǎo)致癲癇發(fā)作[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者血清miR-21水平明顯升高，其原因可能是由于miR-21在星形膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟過程中起到一定抑制作用，已有研究報道顯示，miR-21會抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能異常，并且miR-21能夠活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3, STAT3)信號通路以增強(qiáng)磷脂酰肌醇聚糖6蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)急性缺血性脊髓損傷的發(fā)生。磷脂酰肌醇聚糖6蛋白參與縫隙連接的形成，其表達(dá)水平的升高會促進(jìn)神經(jīng)元之間縫隙連接的產(chǎn)生，從而促進(jìn)神經(jīng)元同步化放電[18]。miR-146a則是由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一類miRNA，Sison等[19]發(fā)現(xiàn)在病理條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的過量miR-146a會下調(diào)神經(jīng)元的數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致脊髓型肌萎縮的發(fā)生。由于癲癇患者中普遍能夠觀察到發(fā)育異常的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量miR-146a至胞外，從而導(dǎo)致血清miR-146a水平升高。

表3 血清miR-21和miR-146a表達(dá)水平診斷癲癇的ROC 分析

本研究探討血清miR-21和miR-146a與癲癇發(fā)病之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，癲癇患者體內(nèi)存在一定程度的炎性反應(yīng)，并且伴隨炎性反應(yīng)的發(fā)生血清miR-21和miR-146a也隨之升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者血清miR-21和miR-146a的升高與炎性反應(yīng)發(fā)生之間存在聯(lián)系，并且與癲癇病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。癲癇發(fā)作與炎性反應(yīng)聯(lián)系密切，腦部炎性反應(yīng)的產(chǎn)生會導(dǎo)致腦部生理環(huán)境及局部微環(huán)境發(fā)生紊亂，內(nèi)環(huán)境中神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)因子、細(xì)胞因子水平紊亂會造成神經(jīng)元放電異常，導(dǎo)致癲癇發(fā)生。miR-21與炎性反應(yīng)的聯(lián)系在既往研究中并不少見，Xue等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒性休克患者血清中miR-21水平明顯升高，并且miR-21參與炎性小體的形成和激活。Venugopal等[21]的研究表明，miR-21是NF-κB炎性反應(yīng)信號通路的下游靶基因，核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信號通路活化在引起TNF-α和IL-6等炎性因子水平升高的同時會上調(diào)miR-21表達(dá)。癲癇發(fā)作過程中炎性反應(yīng)水平升高并且炎性相關(guān)信號通路活化，使TNF-α和IL-6等炎性因子水平及miR-21升高，miR-21表達(dá)水平升高促進(jìn)炎性小體的形成，從而對炎性反應(yīng)起到正反饋調(diào)節(jié)的作用，使炎性反應(yīng)的強(qiáng)度和范圍逐步擴(kuò)大，加劇癲癇患者病情。miR-146a同樣參與炎性反應(yīng)過程，如Sun等[22]研究表明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體(cxc chemokin receptor 4,CXCR4)基因是miR-146a的靶基因，miR-146a作用于CXCR4 mRNA的3’端并促進(jìn)其降解，導(dǎo)致CXCR4蛋白表達(dá)水平升高。而CXCR4是十分重要的炎性反應(yīng)抑制分子，miR-146a下調(diào)CXCR4蛋白表達(dá)會導(dǎo)致炎性反應(yīng)加劇。同時，Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染會促進(jìn)miR-146a的產(chǎn)生及NF-κB信號通路活化，NF-κB信號通路活化促進(jìn)IL-8、CC趨化因子配體5(CC chemokine ligand 5,CCL5)和干擾素β(interferon β,IFN-β)等炎性因子的釋放，導(dǎo)致炎性因子水平升高。miR-146a與NF-κB信號通路之間存在正反饋調(diào)節(jié)，miR-146a水平升高促進(jìn)NF-κB信號通路的活化，使得炎性反應(yīng)進(jìn)一步加劇。因此在癲癇患者體內(nèi)，一方面炎性反應(yīng)的發(fā)生會上調(diào)miR-146a水平，另一方面，miR-146a表達(dá)量上調(diào)會促進(jìn)NF-κB信號通路的活化，進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)，導(dǎo)致癲癇患者病情加重[24]。

ROC曲線結(jié)果還顯示，血清miR-21和miR-146a聯(lián)合檢測的敏感度和特異度明顯高于各指標(biāo)單獨檢測，分析其原因可能是由于血清miR-21和miR-146a單獨檢測具有一定的漏檢率，二者聯(lián)合檢測能夠有效降低漏檢率，從而提高檢測的敏感度和特異度，并且研究結(jié)果提示血清miR-21和miR-146a聯(lián)合檢測可以作為癲癇發(fā)作的輔助標(biāo)志物。

綜上所述，癲癇患者血清miR-21和miR-146a水平及炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，血清miR-21、miR-146a與炎性因子TNF-α、IL-6水平及NHS3評分均呈正相關(guān)，在癲癇患者的診斷中具有一定臨床價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃忠：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；曾義：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;王曦：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；趙戈：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核