先天性高胰島素血癥18例臨床特征和遺傳學(xué)分析

徐子迪，張琳，曾俏，吳玉筠，劉敏，閆潔，桑艷梅

先天性高胰島素血癥(congenital hyperinsulinism，CHI)是一種遺傳異質(zhì)性疾病，其主要特征是難治性低血糖及與血糖水平不相稱的相對高胰島素血癥，是嬰幼兒和兒童時期持續(xù)性、復(fù)發(fā)性低血糖的重要原因。迄今已發(fā)現(xiàn)了至少14種基因突變與先天性高胰島素血癥有關(guān)，相應(yīng)地構(gòu)成13種遺傳學(xué)類型[1-4]。另外有近50%的CHI患者未發(fā)現(xiàn)攜帶上述14種基因突變，提示對CHI患者進(jìn)行進(jìn)一步遺傳學(xué)研究極為必要。不同類型CHI 患兒的臨床特征、治療方案、治療效果及預(yù)后不盡相同?，F(xiàn)選取先天性高胰島素血癥患兒18例為研究對象，對其臨床資料及致病基因攜帶情況進(jìn)行分析，以期提高臨床醫(yī)師對本病的認(rèn)識，并為CHI患兒診療方案的制定、預(yù)后的判斷等提供理論依據(jù)，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015年12月—2018年10月北京兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科收治先天性高胰島素血癥患兒18例為研究對象，均符合CHI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，符合低血糖的診斷。其中男7例，女11例，起病年齡生后1 d～1歲2個月，中位起病年齡為45 d，出生體質(zhì)量2.7～4.9(3.74±0.68)kg；足月胎齡兒10例，巨大兒8例。首發(fā)癥狀：抽搐17例，反應(yīng)弱1例。 本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 輔助檢查

1.2.1 常規(guī)檢查：18例患兒空腹血糖0.96～2.60 mmol/L，低血糖發(fā)作時胰島素2.15～33.79 μIU/L，伴無癥狀性高氨血癥4例，血氨78～216 μmol/L(18～72 μmol/L)；血、尿、便常規(guī)及ACTH、甲功五項、生長激素等檢查未見明顯異常。

1.2.2 影像學(xué)檢查： 18例患兒行腹部超聲等常規(guī)影像學(xué)檢查未見明顯異常。1例患兒行18F-L-DOPA-PET胰腺掃描提示組織學(xué)為彌漫型。

1.2.3 遺傳學(xué)分析：分別留取患兒及父母的乙二胺四乙酸鈉(EDTA)抗凝靜脈血3 ml，進(jìn)行二代測序分析和一代測序驗(yàn)證。二代測序技術(shù)路線：參考文獻(xiàn)[1-4]及OMIM數(shù)據(jù)庫信息，將與低血糖相關(guān)的基因組外顯子區(qū)通過捕獲探針進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子捕獲。一代測序(Sanger法)驗(yàn)證：經(jīng)二代測序發(fā)現(xiàn)7例患兒分別攜帶ABCC8、GLUD1基因突變。根據(jù)基因所驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計引物，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，用ABI 3730XL 測序儀測序，測序引物采用原PCR引物?；蛐蛄蟹治霾捎肈NASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對。如突變未遺傳自父母，進(jìn)行親子鑒定試驗(yàn)證實(shí)先證者與其父母的血緣關(guān)系，從而判斷突變是否為新生突變。數(shù)據(jù)庫分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測：參照單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dsSNP)和千人組基因庫，未見收錄；通過搜索在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫等明確突變是否曾經(jīng)有過報道。

18例患兒中，攜帶ABCC8基因或GULD1基因突變7例(38.9%)，未發(fā)現(xiàn)已知CHI相關(guān)致病基因突11例，見表1。3例患兒攜帶ABCC8基因(NM_000352.3)突變，共包括5種突變類型，其中2種突變尚未見文獻(xiàn)報道，見圖1。分別用人類基因組變異軟件Provean、SIFT、MaxEntScan預(yù)測新突變的致病性,最后用ACMG標(biāo)準(zhǔn)對新突變進(jìn)行綜合分析鑒定，結(jié)果顯示：本研究新發(fā)現(xiàn)的ABCC8基因c.3736T>C和c.149-2A>C突變可能具有致病性。4例患兒攜帶GULD1基因(NM_005271.4)突變，見圖2，既往文獻(xiàn)均已有報道。

1.3 診斷 18例患兒入院后經(jīng)相關(guān)檢查均確診為先天性高胰島素血癥，診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)高胰島素血癥(血漿胰島素>2 μIU/ml)；(2)低脂肪酸血癥(血漿游離脂肪酸<1.5 mmol/L)；(3)低酮血癥(血漿β-羥丁酸<2.0 mmol/L)；(4)1 mg靜脈胰高血糖素試驗(yàn)反應(yīng)：血糖變化>30 mg/dl。

注：A、B.例2；C.例5；D、E.例14

注：A.例6；B.例8；C.例9；D、E.例17

1.4 治療及預(yù)后 18例患兒中，1例通過靜脈滴注葡萄糖和加強(qiáng)喂養(yǎng)維持正常血糖水平，17例患兒確診后曾應(yīng)用二氮嗪(5～15 mg·kg-1·d-1)進(jìn)行試驗(yàn)性治療，以5 mg·kg-1·d-1為起始量口服，每日2次,根據(jù)血糖檢測情況酌情調(diào)整劑量，療程7～10 d;同時加用氫氯噻嗪1 mg·kg-1·d-1口服，每日3次，以防止二氮嗪所導(dǎo)致的水鈉潴留,并予以10%氯化鉀1～2 ml·kg-1·d-1口服，每日3次，以防止氫氯噻嗪所導(dǎo)致的低鉀血癥。因二氮嗪的半衰期較長(9.5～24 h)，故評價二氮嗪的療效至少應(yīng)在治療5 d后進(jìn)行。該藥治療有效的指標(biāo)：正常飲食條件下，如患兒空腹血糖可維持>3.0～3.8 mmol/L考慮有效，禁食時間：新生兒4 h、嬰兒8 h、年長兒12 h。如果應(yīng)用二氮嗪最大劑量15 mg·kg-1·d-1治療5 d仍不能滿足此標(biāo)準(zhǔn)時，則考慮為二氮嗪治療無效[6]。12例應(yīng)用二氮嗪治療后，空腹血糖水平可維持在正常水平，其余5例患兒應(yīng)用最大劑量二氮嗪15 mg·kg-1·d-1治療5 d后，仍頻繁出現(xiàn)低血糖發(fā)作，提示患兒對二氮嗪治療無效停用。

經(jīng)長期隨訪，1例未試用二氮嗪治療的患兒失訪；二氮嗪治療有效的患兒中，繼續(xù)長期口服二氮嗪10例,二氮嗪減停后血糖可維持正常，自行緩解2例；二氮嗪治療無效的患兒中，換用奧曲肽治療有效4例，長期口服；另1例通過加強(qiáng)喂養(yǎng)維持正常血糖水平。2例GDH-HI患兒發(fā)生癲癇。

2 討 論

本組患兒CHI致病基因檢出率為38.9%，低于歐美相關(guān)文獻(xiàn)報道的比例，考慮與樣本量較小或人種差別有關(guān)[7]。

KATP-HI是CHI最常見和最嚴(yán)重的類型，是由于編碼ATP敏感性鉀通道的ABCC8和KCNJ11基因發(fā)生功能喪失性突變引起的[7]。迄今已發(fā)現(xiàn)400多種ABCC8突變和60多種KCNJ11突變類型，其遺傳方式多為常染色體隱性遺傳，少數(shù)為常染色體顯性遺傳[8-11]。

復(fù)合雜合突變在KATP-HI患兒中比較少見，迄今文獻(xiàn)報道約60余例。攜帶復(fù)合雜合子突變的患兒通常對二氮嗪治療無效[12]。本組3例KATP-HI患兒中，2例(例2、14)攜帶ABCC8基因復(fù)合雜合突變,遺傳方式均為常染色體隱性遺傳，其中1例為巨大兒，1例出生體質(zhì)量正常；均于生后第1天起病；確診后均曾試用二氮嗪進(jìn)行治療，結(jié)果顯示均對二氮嗪無效。符合文獻(xiàn)報道的常染色體隱性遺傳KATP-HI患兒的臨床特征。

文獻(xiàn)報道顯示，由父系遺傳的ABCC8或KCNJ11基因雜合突變，其遺傳方式存在2種可能：一種是常染色體隱性遺傳，患兒體細(xì)胞攜帶父系A(chǔ)BCC8或KCNJ11基因突變伴患兒胰腺病灶內(nèi)母系11p15.1染色體等位基因缺失。這種父系單親二倍體表達(dá)了父系遺傳的基因突變，同樣導(dǎo)致了大量印記基因的不平衡表達(dá),包括母系遺傳的腫瘤抑制基因H19和CDKN1C及父系遺傳的胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor-2，IGF2)等，最終導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞的增生從而發(fā)展成局灶性腺瘤，此為胰腺局灶型病變的遺傳學(xué)基礎(chǔ)[13]；該類患兒起病均較早，低血糖癥狀均較重，且對二氮嗪治療多無效。另一種可能為常染色體顯性遺傳，在臨床上相對少見。該類患兒起病年齡稍晚于常染色體隱性遺傳患兒，臨床癥狀較輕，部分患兒對二氮嗪治療有效。本組中例5發(fā)現(xiàn)了1個父系遺傳的ABCC8基因c.149-2A>C突變，為剪切突變，目前尚未見文獻(xiàn)報道。該患兒起病較早，出生體質(zhì)量3.7 kg，對二氮嗪治療無效，符合KATP-CHI常染色體隱性遺傳的特征。因未能對胰腺病灶進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記分析，暫不能明確患兒是否存在母系11p15.1染色體等位基因的缺失。根據(jù)局灶型病變的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，建議該類患兒有條件者應(yīng)行18F-L-DOPA PET胰腺掃描明確胰腺組織學(xué)類型，如確定病變?yōu)榫衷钚停尚幸认倬植壳谐g(shù)達(dá)到根治的目的。

ABCC8基因編碼的SUR1含有17個跨膜螺旋體，分別組成細(xì)胞外的N端橫跨膜結(jié)構(gòu)TMD0、TMD1和TMD2以及位于細(xì)胞內(nèi)緊隨TMD1和TMD2結(jié)構(gòu)的2個核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域：NBD1和NBD2。SUR1的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域NBD1和NBD2，可以感知ATP/ADP的濃度變化，將信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)。NBD1對MgATP的親和力更強(qiáng)，而對其水解作用較弱；NBD2的作用則是通過結(jié)合MgATP，將其水解成MgADP，從而激活KATP通道。本組病例2的p.Y179C突變位于TMD1結(jié)構(gòu)域，p.W1246R突變位于NBD2結(jié)構(gòu)域。例5的剪切位點(diǎn)突變位于TMD0結(jié)構(gòu)域。例14的p.D1471N突變位于NBD2結(jié)構(gòu)域，p.R74Q突變位于TMD0結(jié)構(gòu)域。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多ABCC8基因不同區(qū)域的突變，如位于NBD2區(qū)域的突變，它們均不影響KATP通道的正常結(jié)構(gòu)或表達(dá)能力，但是它們都很明顯的減少甚至喪失了對MgADP及二氮嗪的反應(yīng)能力。由于KATP通道與MgADP的反應(yīng)能力下降，ATP/ADP比率增高，導(dǎo)致β細(xì)胞膜中ATP敏感的鉀離子通道關(guān)閉，K+離子外流減少,細(xì)胞內(nèi)K+離子濃度增加，細(xì)胞內(nèi)陽離子增加導(dǎo)致細(xì)胞膜上的部分區(qū)域去極化，激活電壓門控L型鈣通道，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加，與神經(jīng)末梢釋放的遞質(zhì)相似，從而使胰島素釋放增加，引發(fā)高胰島素血癥[14]。

GDH-HI是CHI的第二種常見類型, 是由于線粒體谷氨酸脫氫酶的功能增強(qiáng)性突變引起[15]。該型患兒最主要的臨床表現(xiàn)是空腹性低血糖和高蛋白飲食所導(dǎo)致(即蛋白質(zhì)敏感的)的低血糖，對二氮嗪治療均有效。GDH-HI患兒的另一個重要特征為無癥狀性高氨血癥[16]，該類患兒的血氨濃度一般為正常值高限的3～5倍。

本組4例患兒攜帶GLUD1基因新生突變，經(jīng)遺傳學(xué)確診為GDH-HI。該組患兒均為足月適于胎齡兒，低血糖癥狀均較明顯，血氨介于90～216 μmol/L之間，最高可達(dá)正常高限的3倍，均對二氮嗪治療有效，符合文獻(xiàn)報道的GDH-HI臨床特征。例9起病較早，于生后1 d即出現(xiàn)反復(fù)抽搐，表現(xiàn)出嚴(yán)重低血糖，提示GDH-HI有于新生兒期起病者，屬于該型CHI中少見的新生兒期發(fā)病的病例。其余3例患兒均于新生兒期以后起病，與既往文獻(xiàn)報道一致。

根據(jù)國外文獻(xiàn)報道，GDH-HI患兒易發(fā)生癲癇。該類患兒發(fā)生癲癇的機(jī)制可能是由于：(1)長期復(fù)發(fā)的低血糖導(dǎo)致低血糖性腦??；(2)長期的高氨血癥；(3)大腦中谷氨酸脫氫酶的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致谷氨酸鹽含量及神經(jīng)遞質(zhì)氨基丁酸減少等[17]。本組4例患兒中，經(jīng)長期隨訪，例6和例9確診為癲癇，符合GDH-HI的臨床特征。

隨著研究的不斷深入，迄今已發(fā)現(xiàn)了至少37種GLUD1基因雜合錯義突變，主要集中于GLUD1基因的第6、7、10、11、12外顯子區(qū)[18]。本組4例GDH-HI患兒共發(fā)現(xiàn)3種GLUD1基因突變類型，既往文獻(xiàn)均有報道。GDH-HI的遺傳方式多為新生突變或常染色體顯性遺傳，其中新生突變約占80%[18]。本組4例GDH-HI患兒GLUD1基因突變均為新生突變，遺傳方式與既往報道一致[2]。2017年，Stanley CA團(tuán)隊報道了1例特殊的GDH-HI患兒，患兒同時攜帶母系遺傳的GLUD1基因c.37delC移碼突變和新生c.1493C>T(p.S445L)錯義突變[19]?；純簽榕?，孕39周出生，出生體質(zhì)量3.7 kg，生后12 h即出現(xiàn)嚴(yán)重的低血糖驚厥并伴有高氨血癥，對二氮嗪治療有效，提示GDH-HI患兒可能有著更復(fù)雜的臨床表型和遺傳背景。

總之，CHI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不同遺傳學(xué)類型的CHI患者其臨床表現(xiàn)、治療方案及預(yù)后也不盡相同。攜帶ABCC8基因突變者通常起病較早，多對二氮嗪治療無效。攜帶GLUD1基因突變的患兒起病相對較晚，均對二氮嗪治療有效，該型患兒有發(fā)生癲癇的傾向，臨床需注意密切隨診。及時進(jìn)行CHI相關(guān)致病基因突變分析，對于判斷CHI患者的遺傳學(xué)類型、診療方案的確立及預(yù)后的判斷均有著重要的意義。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

徐子迪：設(shè)計研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；張琳、曾俏：統(tǒng)計分析、資料搜集整理；吳玉筠、劉敏、閆潔：提出研究思路，資料搜集；桑艷梅：課題選擇與設(shè)計，論文審核