谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對全麥面團(tuán)特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響

王佳玉，陳鳳蓮，吳 迪，湯曉智,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

全麥粉是由整粒小麥研磨而成，包含了胚乳、麩皮與胚芽，含有豐富的膳食纖維和多種微量元素，長期攝入可有效預(yù)防糖尿病、心血管疾病等慢性疾病的發(fā)生[1]。但由于全麥粉中存在著大量纖維，致使全麥?zhǔn)称返目诟匈|(zhì)地及消費(fèi)者可接受度降低[2]。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（glutamine transaminase，TG）能催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，可以有效改善面團(tuán)的流變特性[3]。魏曉明等[4]研究發(fā)現(xiàn)，TG能夠促進(jìn)蕎麥面條中蛋白質(zhì)交聯(lián)，使得蕎麥面條的微觀結(jié)構(gòu)得到改善，同時提升了蕎麥面團(tuán)的加工特性及面條的品質(zhì)。Huang Weining等[5]通過添加TG研究其對燕麥面團(tuán)流變學(xué)和熱學(xué)性質(zhì)的影響，結(jié)果表明添加TG改變了燕麥面團(tuán)的熱機(jī)械性能，TG的加入對儲能模量（G’）和損耗模量（G’’）有顯著影響，并證實(shí)了TG催化燕麥蛋白質(zhì)交聯(lián)。彭飛等[6]通過在燕麥中添加TG改善面條蒸煮品質(zhì)。Niu Meng等[7]研究了TG和葡萄糖氧化酶對全麥面團(tuán)中蛋白質(zhì)聚合的影響。本研究著重探討TG添加量及作用時間對全麥面團(tuán)的混合特性、拉伸特性、流變特性、微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化的影響，旨在為提高全麥?zhǔn)称菲焚|(zhì)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全麥粉（淀粉65.65%、蛋白質(zhì)14.75%、脂肪2.02%、粗纖維1.53%、水分11.63%） 海寧中糧面業(yè)有限公司；TG（12 000 U/g） 泰興市東圣生物科技有限公司；4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液（含巰基）、5h Tris-甘氨酸電泳緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；OCT冰凍切片包埋劑 北京瑞茂宏達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀 法國肖邦技術(shù)公司；冷凍切片機(jī)深圳達(dá)科為醫(yī)療設(shè)備有限公司；TM-3000掃描電鏡日本日立公司；Anton Paar MCR 302動態(tài)流變儀 奧地利安東帕有限公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Microsystems公司；Nikon Ti-E-AIR型激光共聚焦顯微鏡日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

TG添加到全麥粉中，添加量為0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 U/g（按全麥粉質(zhì)量計(jì)），與全麥粉混合均勻后備用。

1.3.2 面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)特性測定

采用Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀，測定程序?yàn)镃hopin+，面團(tuán)質(zhì)量規(guī)定75 g。其中每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 拉伸特性測定

參考Liu Wenjun等[8]的方法。樣品采用Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀混成的面團(tuán)，在扭矩達(dá)1.1 Ng m時取出面團(tuán)，放入質(zhì)構(gòu)儀SMS/KIE拉伸測定的面團(tuán)制備槽中，并用壓板壓制成2 mmh 60 mm的面團(tuán)條。靜置90 min后，將面團(tuán)條從面團(tuán)制備槽中取出，放在質(zhì)構(gòu)儀面團(tuán)的拉伸位置，探頭上升直到面團(tuán)條斷裂，得到面團(tuán)的抗拉伸力（g）及拉伸距離（mm）。

1.3.4 流變特性測定

參考Torbica等[9]的方法測定TG添加量和作用時間對全麥面團(tuán)樣品流變特性的影響，測定方法稍作修改。樣品取Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀制備的面團(tuán)，面團(tuán)樣品在扭矩為1.1 Ng m時取出，并用保鮮膜包裹靜置15、45、60、90、120 min。使用Anton Paar MCR 302流變儀，采用平板直徑為25 mm的轉(zhuǎn)子（PP25），設(shè)定平板間距為1 mm。面團(tuán)樣品裝載完成后，設(shè)定靜置時間為10 min，以消除殘余應(yīng)力，并用礦物油密封面團(tuán)邊緣，防止水分散失。測得樣品線性黏彈區(qū)為0.01%～1.0%，設(shè)定頻率變化范圍為0.1～20.0 Hz，樣品測試溫度為25 ℃，獲得面團(tuán)的儲能模量（G’）、黏性模量（G”）和黏性角正切值tanδ（G’/G”）。

1.3.5 掃描電鏡觀察

參照湯曉智等[10]的方法稍作修改，取Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀混合時扭矩達(dá)1.1 Ng m時取出的面團(tuán)樣品，并用保鮮膜包裹，靜置90 min。靜置后面團(tuán)放入-20 ℃冰箱12 h，取出后冷凍干燥（-80 ℃，72 h），離子濺射噴金后掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.6 激光共聚焦顯微鏡觀察

參考Han Wen等[11]的方法稍作修改，將制備的不同添加量TG的面團(tuán)樣品與包埋劑放入-20 ℃冰箱12 h，使用萊卡VT1200S型振動切片機(jī)從面團(tuán)內(nèi)部切下厚度為10 μm的薄片，立即轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上，用熒光染料羅丹明B（0.1 μg/mL）和異硫氰酸熒光素（0.1 μg/mL ）染色后使用Nikon A1激光共聚焦顯微鏡100 倍下觀察，設(shè)置通道發(fā)射波長為488.0 nm和543.5 nm，1 024h 1 024分辨率下觀察圖片。

1.3.7 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化

參考Luo Yun等[12]的方法測定加入TG后全麥面團(tuán)樣品中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化。TG處理后的面團(tuán)樣品放入-20 ℃冰箱12 h，將冷凍處理后的面團(tuán)樣品進(jìn)行冷凍干燥（-80 ℃，72 h），并研磨成凍干粉過60 目篩。取面團(tuán)樣品凍干粉7 mg放入離心管中，加入稀釋后的蛋白質(zhì)上樣緩沖液1 mL，混合均勻后沸水浴加熱5 min，12 000hg離心15 min，取上清液10 μL加入凝膠中，電泳濃縮膠設(shè)定電壓80 V，分離膠電壓100 V。凝膠用0.25%考馬斯亮藍(lán)染色，20%甲醇和10%乙酸脫色。

1.4 數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 16.0和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 TG對全麥面團(tuán)混合特性的影響

表1 TG對全麥面團(tuán)混合特性的影響Table 1 Effect of TG on mixing characteristics of whole wheat dough

如表1所示，隨著TG添加量的增加，全麥面團(tuán)在混合過程中吸水率、面團(tuán)形成時間、穩(wěn)定時間、蛋白質(zhì)弱化度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，峰值黏度呈上升趨勢，回生值顯著下降。李鑫等[13]研究TG對小麥粉品質(zhì)影響結(jié)果顯示，添加TG可以促進(jìn)蛋白分子聚集，改善面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得面團(tuán)的形成時間和穩(wěn)定時間增加。Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀可以反映面團(tuán)混合過程中機(jī)械剪切應(yīng)力和溫度雙重作用下蛋白質(zhì)和淀粉特性的變化，而面團(tuán)的形成過程實(shí)質(zhì)上是面筋蛋白吸水形成面筋網(wǎng)絡(luò)的過程，因此隨著TG添加量升高，短時間內(nèi)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)局部交聯(lián)聚集，反而影響了面筋蛋白吸水形成良好面筋網(wǎng)絡(luò)的過程，游離于面筋結(jié)構(gòu)外可糊化的淀粉總量增加，從而導(dǎo)致吸水率下降，面團(tuán)形成時間、穩(wěn)定時間先升后降，蛋白弱化度升高以及淀粉峰值黏度升高。隨著TG添加量的增加回生值顯著降低，由于全麥面團(tuán)在機(jī)器中攪拌時間以及酶反應(yīng)時間的延長，TG較充分地誘導(dǎo)了全麥面團(tuán)中蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，形成良好的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時面團(tuán)體系變得均勻，糊化后淀粉均勻鑲嵌在面筋結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致在降溫過程中回生值降低[14]，這與王雨生等[15]研究結(jié)果一致?；厣档慕档陀欣谔嵘姹寒a(chǎn)品的品質(zhì)及延長貨架期。

2.2 TG對全麥面團(tuán)拉伸特性的影響

表2 TG對全麥面團(tuán)拉伸特性的影響Table 2 Effect of TG on tensile properties of whole wheat dough

如表2所示，隨著TG添加量的增加，拉伸阻力隨之增加。拉伸距離與拉伸阻力呈現(xiàn)出相反趨勢，說明TG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，形成大分子的聚集體，其有效增強(qiáng)了全麥面團(tuán)的強(qiáng)度，但使其延展性變差，從而導(dǎo)致拉伸阻力的增加和拉伸距離減小[16]。當(dāng)TG添加量3.0 U/g時，面團(tuán)強(qiáng)度有所下降，結(jié)合Mixolab混合實(shí)驗(yàn)儀結(jié)果可知，適當(dāng)控制酶反應(yīng)時間對蛋白質(zhì)的交聯(lián)以及良好的面筋網(wǎng)絡(luò)的形成至關(guān)重要，也直接影響了面團(tuán)的拉伸特性。

2.3 TG對全麥面團(tuán)流變特性的影響

由圖1可知，在不同的反應(yīng)時間下，所有全麥面團(tuán)隨著TG添加量的增加，G’隨之增加。隨著反應(yīng)時間的延長，G’相應(yīng)增加。結(jié)果表明TG誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，顯著增加了全麥面團(tuán)的強(qiáng)度[17-19]。添加TG后全麥面團(tuán)樣品的G”變化（圖2）與G’的變化結(jié)果相似，均呈現(xiàn)隨著添加量的增加以及反應(yīng)時間的延長持續(xù)增加。全麥面團(tuán)的綜合黏彈性可以用損耗角正切值（tanδ）反映（圖3）[20]。全麥面團(tuán)的tanδ值與其黏性和彈性模量呈現(xiàn)出相反的變化趨勢，即TG添加量越高，tanδ值越低。當(dāng)酶反應(yīng)時間達(dá)到120 min時，各添加水平的綜合黏彈性變化曲線趨于重合，tanδ值不再繼續(xù)降低，甚至開始升高。由結(jié)果分析，TG的加入進(jìn)一步促進(jìn)了全麥面團(tuán)中蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)，并聚集纏繞，形成良好的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，一定程度上消除了全麥中粗纖維等對面團(tuán)強(qiáng)度的影響，使得全麥面團(tuán)的黏彈性增加。但當(dāng)過量添加或者過長時間反應(yīng)，易造成蛋白質(zhì)過量交聯(lián)及聚集，反而不利于全麥面團(tuán)的綜合黏彈性。Ndayishimiye等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TG減少了谷蛋白和麥醇溶蛋白的含量，同時引入了新的交聯(lián)鍵，導(dǎo)致G’和G’’增加。隨著TG添加水平的增加以及反應(yīng)時間的延長，會形成更多的交聯(lián)[22]。Bauer等[23]研究也表明，TG添加使得小麥面團(tuán)強(qiáng)度增加，但TG濃度過高會導(dǎo)致面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完全喪失，面團(tuán)加工性能變差。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)選擇合適的TG濃度同時適度控制酶反應(yīng)時間。

圖1 TG添加量及反應(yīng)時間對全麥面團(tuán)彈性模量（G’）的影響Fig.1 Effect of TG dosage and reaction time on G’ of whole wheat dough

圖2 TG添加量及反應(yīng)時間對全麥面團(tuán)黏性模量（G”）的影響Fig.2 Effect of TG dosage and reaction time on G” of whole wheat dough

圖3 TG添加量及反應(yīng)時間對全麥面團(tuán)損耗角正切值（tanδ）的影響Fig.3 Effect of TG and reaction time on tanδ of whole wheat dough

2.4 掃描電鏡觀察結(jié)果

全麥面團(tuán)（圖4a）中因存在大量麩皮，使得面筋結(jié)構(gòu)在形成過程中被阻斷，導(dǎo)致面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量孔洞和斷面。圖4b與4c顯示了添加TG后全麥面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的變化，從圖中可知，添加TG后，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空洞與斷面明顯減少，面筋結(jié)構(gòu)變得連續(xù)均勻，淀粉顆粒、纖維被很好地分散在面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，說明在TG的作用下，面筋蛋白發(fā)生聚集與交聯(lián)，全麥面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)得到明顯改善[24-25]。對比不同添加量，酶反應(yīng)時間為90 min條件下，TG添加量為3.0 U/g時全麥面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)較1.8 U/g更加完整緊致。

圖4 掃描電鏡觀察TG對全麥面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of TG on microstructure of whole wheat dough observed by SEM

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

未添加TG的全麥面團(tuán)（圖5a）中存在大量麩皮，破壞了面團(tuán)內(nèi)部連續(xù)結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量空洞；添加TG后的全麥面團(tuán)如圖5b、c所示，可以明顯觀察到在TG的作用下面團(tuán)中的孔洞數(shù)量及斷裂空隙減少，麩皮周圍結(jié)構(gòu)變得連續(xù)，面筋交聯(lián)緊密[26]。同時，從圖中可以觀察到，當(dāng)添加量為3.0 U/g時，面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)中的連續(xù)性優(yōu)于1.8 U/g添加量時的面團(tuán)，其可以將麩皮與面筋結(jié)構(gòu)的結(jié)合的更加緊密，在麩皮存在處減少斷裂空隙，增加面團(tuán)整體的連續(xù)性，利于加工。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察TG對全麥面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of TG on microstructure of whole wheat dough observed by CLSM

2.6 TG對全麥面團(tuán)蛋白質(zhì)變化的影響

圖6 TG對全麥面團(tuán)中蛋白質(zhì)變化的影響Fig.6 Effect of TG on SDS-PAGE protein profile of whole wheat dough

從圖6可以清晰觀察到加入TG后蛋白質(zhì)變化的情況。與全麥粉樣品條帶相比，TG樣品條帶在20～100 kDa處總體減少，在100～245 kDa處增加。從變化可知，TG的加入，使得小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)減少，小分子蛋白質(zhì)相互交聯(lián)并聚集成大分子蛋白質(zhì)，從而使得大分子質(zhì)量處條帶增加；在TG樣品條帶上端（分離和堆積凝膠頂部）顯示出大的聚集體（分子質(zhì)量大于245 kDa的蛋白質(zhì)），說明TG的存在使得大量小分子蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集成大分子[27-28]，面筋蛋白的適當(dāng)交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以有效彌補(bǔ)麩皮對面團(tuán)的影響，使全麥面團(tuán)內(nèi)部結(jié)構(gòu)連續(xù)均勻[29]，有研究表明[30]，TG催化形成的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)對面粉或面團(tuán)中面筋蛋白分子質(zhì)量有很大影響，TG處理面粉或面團(tuán)后，麥醇溶蛋白和谷蛋白的含量顯著減少同時大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量增加。Aalami等[31]研究小麥面團(tuán)的電泳結(jié)果表明，TG催化的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，形成了更高分子質(zhì)量的聚合物，且隨著TG濃度的增加，聚合度增加，出現(xiàn)了更高分子質(zhì)量的新條帶。但當(dāng)過度交聯(lián)時可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子質(zhì)量過大，成片聚集，不利于形成良好的面團(tuán)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

隨著TG添加量的增加，全麥面團(tuán)在混合過程中吸水率、面團(tuán)形成時間、穩(wěn)定時間、蛋白質(zhì)弱化度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，峰值黏度呈上升趨勢，回生值顯著下降；拉伸特性結(jié)果驗(yàn)證了TG可以增強(qiáng)面團(tuán)強(qiáng)度；流變特性表明適當(dāng)?shù)腡G添加量及酶反應(yīng)時間使得全麥面團(tuán)的黏彈性增加，但當(dāng)過量添加或者過長時間反應(yīng)，易造成蛋白質(zhì)過量交聯(lián)及聚集，反而不利于全麥面團(tuán)的綜合黏彈性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳、掃描電鏡與激光共聚焦顯微鏡證實(shí)了TG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)和聚集，消除了全麥中纖維等對面團(tuán)強(qiáng)度的影響，使得面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)均勻連續(xù)。