設(shè)施調(diào)控夜間溫度對赤霞珠葡萄果實品質(zhì)的影響

楊 洋，張小虎，張亞紅,,*，李光宗，楊新宇

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

近年來，我國釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴大，經(jīng)過長期的發(fā)展，已逐步形成如新疆、賀蘭山東麓、山東和京津冀等產(chǎn)區(qū)，各產(chǎn)區(qū)氣候條件多樣，產(chǎn)品各具特色。釀酒葡萄除品種和栽培技術(shù)外，產(chǎn)區(qū)氣候、海拔、土壤特性等“風(fēng)土”條件是影響漿果品質(zhì)的重要因素[1]，其中氣候影響最大[2]。溫度是影響不同產(chǎn)區(qū)漿果代謝的主要氣候因子。眾所周知，晝夜溫差大的地區(qū)，植物果實粒重較大，含糖量高。對釀酒葡萄而言，并不是晝夜溫差越大越好，如新疆產(chǎn)區(qū)夏季夜間溫度低，葡萄糖度高，但日間高溫使酸發(fā)育不好，香氣和著色都受到不利影響[3]。而山東產(chǎn)區(qū)夏季夜間溫度高，糖度低，亦對葡萄酒風(fēng)格不利。寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的夜間溫度介于新疆和山東產(chǎn)區(qū)之間。因此，研究不同夜間溫度對葡萄漿果品質(zhì)及香氣的影響，從另一方面可以解釋3 個產(chǎn)區(qū)之間釀酒葡萄品質(zhì)的差異性原因。

研究發(fā)現(xiàn)，溫度對釀酒葡萄含糖量的升高和含酸量的降低均有促進作用，但高溫會抑制葡萄的生長和發(fā)育，造成果實中有機酸和可溶性固形物含量的降低，降低葡萄果實的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]；葡萄花色苷主要是由品種所決定的，但其生物合成還受到氣候因素、土壤條件等調(diào)控[5]，越?jīng)鏊牡貐^(qū)漿果產(chǎn)生的花色苷越多；采收前氣溫日較差越大，越有利于果實中單寧含量的增加[6]，但這些研究是針對氣象因素對果實品質(zhì)的影響，氣候因素較多，導(dǎo)致容易忽視溫度對品質(zhì)影響的重要性。許多研究已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄水平上證實溫度對葡萄漿果成熟和新陳代謝的影響。研究表明，在幼果生長期，溫度升高會刺激糖的積累，從而加速蘋果酸的降解[7-8]，減少花青素[9-10]和芳香物質(zhì)[11]的合成。夜間溫度對總可溶性固形物的影響較小，但對酸度、香氣和花青素的影響較大[12]。研究結(jié)果表明，高溫會阻礙酚類合成，夜間溫度高對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響大于白天高溫[13]。但這些實驗是利用盆栽葡萄在氣候室內(nèi)進行[14-16]，或是在大田條件下對釀酒葡萄果實部位進行溫度調(diào)控研究[8,17]。目前，鮮有關(guān)于夜間溫度影響葡萄果實品質(zhì)的研究報道。

本實驗在葡萄園條件下，于葡萄藤上方搭建溫室，采用空調(diào)調(diào)控設(shè)施內(nèi)夜間溫度的方式，研究不同夜間溫度對葡萄果實品質(zhì)的影響，以期獲得夜間溫度影響果實品質(zhì)的機理，為不同產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄漿果、釀造風(fēng)格獨特的葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以6 a生歐亞種葡萄（Vitis viniferaL.）赤霞珠（Cabernet Sauvignon）為實驗材料。栽培方式為南北行向，單臂“廠”字形整形修剪，每株4～5 個結(jié)果枝，株行距0.8 mh 3.0 m。實驗于2019年5ü 10月在寧夏銀川市寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院葡萄教學(xué)標本圃進行。銀川地處寧夏平原中部，在北緯37°29’～38°53’，東經(jīng)105°49’～106°53’之間，海拔在1 010～1 150 m，年平均氣溫8.5 ℃，實驗期間白天平均溫度27.1 ℃，年平均日照時數(shù)2 800～3 000 h，年平均降水量200 mm左右，無霜期185 d左右，干燥少雨，光照充足，晝夜溫差大，屬于中溫帶干旱氣候區(qū)。實驗區(qū)土壤含礫石、沙粒，以淡灰鈣土為主。

氯化鈉、碳酸鈉、鹽酸、氯化鉀、甲醇、蒽酮（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二酚、單寧酸、福林-酚試劑、福林-丹尼斯試劑 無錫耐思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA-1004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；5804R低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UV757紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；100 μL PDMS固相微萃取針 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 搭建調(diào)控溫室

圖1 溫室示意圖Fig.1 Schematic geometry of the greenhouse

該實驗在大田內(nèi)葡萄植株上方搭建2 間溫室，如圖1所示，每間溫室南北長度8 m，跨度2.8 m，高度2.5 m，頂部弧形高度0.6 m。溫室采用裝配式鋼架結(jié)構(gòu)，南北棚頭采用陽光板密封，夜間溫室頂部覆蓋防水保溫被便于控制夜溫。為避免白天頂部遮陰，設(shè)計卷簾機從溫室頂部東西兩側(cè)升放棉被。在溫室內(nèi)側(cè)棚頭中部1.9 m高度安裝變頻空調(diào)，并在空調(diào)側(cè)下方0.8 m高度處安裝換氣扇，保持2 個溫室內(nèi)只有夜間溫度不同，白天環(huán)境和大田一致。

1.3.2 調(diào)控溫室內(nèi)外氣象參數(shù)

收集2014ü 2018年7、8、9月氣象資料（數(shù)據(jù)來源于寧夏氣象局），計算此期間平均夜間溫度，以此夜間溫度為參考，空調(diào)調(diào)控夜間高溫（high temperature at night，HT，設(shè)置溫度22 ℃）和夜間低溫（low temperature at night，LT，設(shè)置溫度17 ℃），自然環(huán)境為對照（CK），共3 個處理小區(qū)，每處理10 株葡萄，每株約8 穗果。夜間溫度調(diào)控從漿果轉(zhuǎn)色前10 d開始，共處理35 d。每晚日落后覆蓋棉被并開啟空調(diào)進行溫度調(diào)控；次日早上日出前揭掉棉被并關(guān)閉空調(diào)；在每個處理小區(qū)內(nèi)均勻設(shè)置3 組溫濕度記錄儀測定溫濕度。實驗期間3 個處理白天溫度和光照等環(huán)境條件一致。從整體調(diào)控效果看，換氣扇最大限度保證了各處理的濕度和CO2濃度相比自然條件沒有顯著變化，溫度調(diào)控效果較為理想。不同處理氣象參數(shù)值及夜間溫度變化如表1和圖2所示。

表1 不同夜間溫度處理后氣象參數(shù)值Table 1 Meteorological parameter values resulting from different night temperature treatments

圖2 不同處理平均夜間溫度變化Fig.2 Changes in average night temperature in different treatments

1.3.3 果實品質(zhì)指標測定

從赤霞珠漿果轉(zhuǎn)色后第5天開始采樣，隔10 d采樣一次。取樣時每個處理從葡萄植株陰陽兩面各隨機選取3 個果穗，共取6 個果穗，取樣放入冰盒帶回實驗室后，每處理分別從果穗上、中、下3 個部位隨機剪取果粒100 粒，每處理3 個生物學(xué)重復(fù)。每處理取一部分鮮樣用于測定果實可溶性固形物、可滴定酸；其余部分用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱，用于測定總糖、單寧、花色苷、香氣等。采用手持糖量計測定可溶性固形物含量；酸堿滴定法測定可滴定酸含量[18]；可溶性糖含量測定采用蒽酮硫酸比色法[19]；葡萄果實中總酚含量的測定采用福林-酚法[20]，單寧含量的測定采用福林-丹尼斯法[21]；花色苷含量用pH值示差法測定[22]；參考楊夫臣等[23]的方法測定類黃酮含量。

1.3.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測定

由于不同夜間溫度處理果實成熟時間不同，故待每個處理果實成熟時分批采樣，用于測定揮發(fā)性香氣物質(zhì)。香氣成分采用頂空固相微萃取方法提取，運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，參照楊曉帆等[24]的方法并稍加修改。

前處理：稱取適量液氮打磨樣品置于頂空瓶中，加3 g氯化鈉，密封，于80 ℃水浴平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min，待萃取結(jié)束后，萃取針在進樣口解吸5 min。

色譜條件：色譜柱：HP-5MS（30 mh 0.25 mm，0.25 μm）；分流比：不分流；載氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度45 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至200 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min速率升至250 ℃，保持4 min。

質(zhì)譜條件：掃描方式為全掃描；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度180 ℃。采集到的質(zhì)譜圖利用NIST譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)釆用Origin 2018軟件進行顯著性方差分析、繪圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 夜間溫度對果實品質(zhì)的影響

2.1.1 夜間溫度對果實糖、酸含量的影響

表2 不同夜間溫度處理后果實糖、酸含量變化Table 2 Changes in sugar and acid content of grape berries in different night temperature treatments

由表2可知，各處理可溶性固形物和可溶性糖含量在果實轉(zhuǎn)色后初期迅速增加，于成熟期緩慢上升至最大；而可滴定酸含量相反，在初期迅速下降，之后呈緩慢下降趨勢，于成熟時下降到最小。在5～25 d，可溶性固形物含量表現(xiàn)為LT＞CK＞HT，且不同處理之間差異顯著；與CK相比，在轉(zhuǎn)色后至成熟時，LT的可溶性糖含量增速最快且始終顯著高于HT和CK，而LT可滴定酸含量的降解較減緩。最終，可溶性糖含量LT較CK顯著提高了11.7%，可滴定酸含量LT較CK顯著提高了16.1%，HT與CK無顯著差異。

2.1.2 夜間溫度對單寧和總酚含量的影響

圖3 夜間溫度處理后果實單寧和總酚含量的變化Fig.3 Changes in tannin and total phenol content of grape berries in different night temperature treatments

從圖3可以看出，轉(zhuǎn)色至成熟期不同處理單寧含量整體呈緩慢下降趨勢，而總酚含量的變化，除在5～15 d略有上升，其余與單寧含量變化相似；在5～15 d，LT與HT之間的單寧和總酚含量無顯著差異，但均與CK有顯著差異；之后LT的單寧含量一直顯著大于HT和CK。果實成熟時，LT的單寧含量較CK顯著提高了16.5%，HT與CK無顯著差異；總酚含量LT較CK顯著提高了16.8%，HT較CK顯著降低了19.1%。

2.1.3 夜間溫度對花色苷和類黃酮含量的影響

葡萄果實從開始轉(zhuǎn)色至成熟，是花色苷由出現(xiàn)到逐漸積累的過程。由圖4可以看出，從轉(zhuǎn)色至成熟時，各處理果實花色苷含量均呈上升趨勢，且LT增幅最大。在15～55 d，果實花色苷含量始終表現(xiàn)為LT＞CK＞HT，且LT與CK之間存在顯著差異；果實成熟時，LT較CK顯著提高了51.7%，而HT與CK無顯著差異。LT的類黃酮含量呈現(xiàn)一直上升的趨勢，而HT和CK表現(xiàn)為先上升后下降再上升的波動趨勢；最終，LT較CK顯著提高了27.9%，HT與CK無顯著差異。

圖4 不同夜間溫度處理后果實花色苷和類黃酮含量的變化Fig.4 Changes in anthocyanin and flavonoid contents of grape berries in different night temperature treatments

2.2 夜間溫度對成熟時果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響

表3 夜間溫度處理對果實揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量的影響Table 3 Effects of different night temperature treatments on composition and proportions of volatile compounds of grape berries

如表3所示，果實成熟時，各處理中均檢測到醛類、酮類、萜烯類、醇類、酯類等揮發(fā)性成分，LT、HT和CK檢測到的香氣種類數(shù)分別為44、38、43。醛類是果實揮發(fā)性組分的主要成分。LT和HT的醛類化合物總的相對含量均高于CK；香氣物質(zhì)中的萜烯類和酯類化合物的相對含量較小，但其嗅覺感官閾值很低，對果實感官特性影響很大。較CK而言，LT顯著增加了萜烯類和酯類化合物的相對含量和種類數(shù)；HT果實中未檢測到烷烴類化合物。

如表4所示，不同夜間溫度處理果實中檢測到的共有揮發(fā)性物質(zhì)11 種，其中5 種為醛類物質(zhì)。具有青草香味的反式-2-己烯醛和乙醛的相對含量較高。在共有揮發(fā)性物質(zhì)中，LT和HT果實中醛類物質(zhì)總的相對含量分別為70.08%和73.45%，分別較CK高51.9%和59.4%。萜烯類化合物β-大馬士酮在LT和HT中的相對含量均高于CK，分別約為1.6 倍和3 倍。

表4 不同夜間溫度處理對果實共有揮發(fā)性物質(zhì)的影響Table 4 Effects of different night temperature treatments on contents of volatile compounds common to different night temperature treatments

圖5 夜間溫度處理果實共有揮發(fā)性物質(zhì)PCA（A）和PLS-DA（B）Fig.5 PCA (A) and PLS-DA (B) plots of volatile compounds common to different night temperature treatments

如圖5A所示，PC1和PC2的貢獻率分別為59.09%和39.70%，累計貢獻率達到98.79%，能夠反映果實揮發(fā)性物質(zhì)的總體狀態(tài)。3 個處理的果實樣品可以被明顯分開，PC1將HT和CK區(qū)分開，分別位于正半軸與負半軸；而LT位于PC2的正半軸，CK和HT位于負半軸。β-大馬士酮對PC1的影響最強，其次為1-辛醇、辛醛、苯乙醇等；壬醛、反式-2-庚烯醛對PC2影響較強；因此，不同夜間溫度對果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)有顯著影響。如圖5B所示，夜間溫度對反式-2-庚烯醛、壬醛、雪松醇、辛醛、1-辛醇影響較大，其得分均大于1.0，而其成分得分均在1.0以下。LT的反式-2-庚烯醛和雪松醇的相對含量大于CK，HT最小。HT的辛醛和1-辛醇相對含量大于LT，CK最小。

2.3 不同夜間溫度處理赤霞珠果實品質(zhì)綜合評價

參考唐永紅[25]的方法，利用OriginPro 2018軟件對不同處理赤霞珠成熟時果實品質(zhì)指標進行PCA，得到各PC相對應(yīng)的特征向量及貢獻率，如表5所示。提出2 個PCq1和q2，方差貢獻率分別為89.14%和5.17%，2 個PC的累計貢獻率為94.31%。根據(jù)PC理論分析，q1和q2兩個PC已經(jīng)能反映不同夜間溫度處理赤霞珠果實的綜合品質(zhì)。

表5 不同夜間溫度處理果實品質(zhì)特征向量與貢獻率Table 5 Characteristic vectors and contribution of principal components to the variance

根據(jù)表5，利用2 個PC各因子特征向量值及貢獻率，可以建立PC及綜合得分表達式：

式中：x1～x7分別代表標準化后的總糖含量、總酸含量、pH值、總酚含量、單寧含量、花色苷含量、類黃酮含量，Q為綜合品質(zhì)得分。

表6 不同處理赤霞珠品質(zhì)綜合評價Table 6 Principal component scores and comprehensive evaluation of Cabernet Sauvignon under different night temperature treatments

如表6所示，對綜合得分進行排序，得分依次為LT＞CK＞HT，得分越高，果實的品質(zhì)越好。

3 討論與結(jié)論

3.1 夜間溫度對果實品質(zhì)的影響

本實驗分析了夜間溫度與葡萄成熟過程中漿果品質(zhì)指標的關(guān)系，認為其與果實干物質(zhì)代謝和積累有直接的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，成熟期白天溫度較高而夜間溫度較低，可使葡萄果實著色良好，含糖量等品質(zhì)都有提高[26]。果實轉(zhuǎn)色后，可滴定酸含量均呈線性下降，高溫會加速蘋果酸的分解[7]，但LT減緩了酸的降解[16]。這與本實驗的結(jié)果一致，LT使呼吸消耗減少，碳水化合物相對積累增多；而且蘋果酸作為葡萄呼吸作用的主要底物，在漿果成熟過程中被呼吸消耗的速率隨溫度的升高而增加。研究發(fā)現(xiàn)，低溫對葡萄漿果汁中的總可溶性固形物的濃度積累沒有顯著影響[15-16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，在處理期間，HT、LT及CK間果實可溶性固形物有顯著差異，這可能與實驗設(shè)計有關(guān)，前人研究采用盆栽葡萄在氣候生長室內(nèi)設(shè)置低溫脅迫的情況下得出的結(jié)論，而本實驗是設(shè)施調(diào)控模擬不同夜間溫度的真實環(huán)境。本實驗還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)色期的HT對果實最終可溶性固形物沒有影響。

研究發(fā)現(xiàn)在低溫（白天30 ℃，夜間15 ℃）和高溫（晝夜連續(xù)30 ℃）條件下，漿果皮中黃酮醇含量無顯著差異[15]，而高溫會使單寧略有減少[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)溫度對花青素和黃酮醇的濃度影響很大，而對果實單寧的積累無影響[8,28]。本實驗中，LT不僅增加了類黃酮的含量，還減緩了單寧和總酚的降解，而HT加速了總酚的降解；果實成熟時，LT單寧和總酚含量均顯著高于CK，而HT總酚含量顯著低于CK。這是因為夜間高低溫改變了氣溫日較差，加速或減緩植物的呼吸消耗速率，為果實二次代謝物的合成提供了不同含量的必備物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)夜晚溫度較高會抑制成熟早期果實中VvCHS、VvF3H、VvDFR等基因表達，從而導(dǎo)致花色苷合成量減少[13]，而低溫會加速花青素的生物合成[29]，且在一定范圍內(nèi)，夜間溫度越低，花色苷的積累越明顯[9]。這與本實驗結(jié)果一致，LT處理的果實花色苷濃度顯著高于CK，且顯著差異從轉(zhuǎn)色期一直維持到收獲；HT僅在實驗處理期顯著低于CK，對果實最終的花色苷含量沒有影響。

3.2 夜間溫度對果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響

本實驗發(fā)現(xiàn)，不同夜間溫度明顯改變了成熟時赤霞珠果實中香氣成分的種類及醛酮類、萜烯類和醇類等化合物在揮發(fā)性香氣成分中所占的相對比例。葡萄果實中的香氣物質(zhì)主要存在于果皮中，果實的風(fēng)味物質(zhì)主要有甜味、酸味和香味[30]，不同果實的香氣種類、濃度和質(zhì)量不一樣，構(gòu)成了葡萄酒不同的風(fēng)格特征和典型性。Ji等[31]研究發(fā)現(xiàn)，冷涼地區(qū)葡萄中C6醛含量的積累更高，王秀芹等[32]認為溫度雖然有利于釀酒葡萄總糖的積累，但高溫不利于香氣的形成。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 個處理果實中檢測到揮發(fā)性香氣物質(zhì)共103 種，但共有揮發(fā)性物質(zhì)只有11 種，且較CK而言HT明顯減少香氣化合物的種類數(shù)量，可見不同夜間溫度影響了香氣物質(zhì)的合成途徑。實驗還發(fā)現(xiàn)果實中醛類化合物種類和相對含量在總香氣化合物中均占有較大的比重，LT和HT均增加了赤霞珠果實中醛類化合物總的相對含量，這可能是溫度對果實中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響有一定的范圍，冷涼環(huán)境有助于葡萄果實香氣物質(zhì)的積累，但短暫的高溫同樣會提高葡萄與葡萄酒的品質(zhì)[33]。雖然揮發(fā)性物質(zhì)中萜烯類和酯類化合物在果實中的占比較小，但其嗅覺感官閾值均很低，二者均會賦予果實品種特殊的香氣特征。如帶有混合果香和花香的萜烯類β-大馬士酮的嗅覺感覺在水中閾值為2～7 ng/L，但對葡萄酒的感官特性影響很大[34]，本實驗中LT處理的果實中萜烯類和酯類化合物總的相對含量均明顯高于CK。本實驗還發(fā)現(xiàn)HT和LT處理的果實中醇類化合物的相對含量均較CK減少，且HT處理的果實中沒有檢測到烷烴類化合物，可見溫度對釀酒葡萄果實香氣物質(zhì)的影響是十分復(fù)雜的。目前，關(guān)于溫度影響果實中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的研究較少，仍需進一步去探討。

本實驗研究結(jié)果表明，在果實轉(zhuǎn)色至成熟期，LT增加了可溶性固形物、總糖、花色苷和類黃酮的積累速率，減緩了總酸、單寧、總酚的降解速率，表現(xiàn)為成熟時較CK都有顯著提高。HT除顯著降低果實總酚以外，對其他品質(zhì)均沒有影響。夜間溫度對成熟時果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類和各成分比重有顯著影響。與CK相比，HT減少了香氣物質(zhì)的種類數(shù)量，但增加了醛類化合物的相對含量；LT提高了醛類、萜烯類和酯類化合物的相對含量；夜間高低溫處理均降低了醇類化合物的相對含量。利用PCA綜合評價不同處理漿果品質(zhì)，結(jié)果顯示綜合品質(zhì)排名依次是LT、CK、HT。因此，LT有助于提升赤霞珠果實品質(zhì)，HT降低了果實品質(zhì)。