固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時分析養(yǎng)殖水體及中華鱉中6種喹諾酮類藥物殘留

許凱倫 蔣倩倩 鄭伊諾 徐匯鑌 陸榮茂 周朝生 胡園

摘要?[目的]通過固相萃取，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時分析水體及水產(chǎn)品中6種喹諾酮類藥物殘留檢測方法。[方法]水質檢測方法取樣量少，生物檢測方法利用乙腈和水作為提取液，并添加DMSO，增進目標物在乙腈中的溶解度從而提高回收率;調查浙江省某地區(qū)20個中華鱉養(yǎng)殖場養(yǎng)殖水體和中華鱉的6種喹諾酮藥物殘留水平。[結果]水質檢出2種喹諾酮殘留，檢出濃度最大值分別為421.06 ng/L（恩諾沙星）、54.20 ng/L（環(huán)丙沙星）;中華鱉樣品中檢出4種喹諾酮殘留，最大檢出濃度分別為3.98 μg/kg（氧氟沙星）、3.22 μg/kg（培氟沙星）、127.44 μg/kg（恩諾沙星）、65.00 μg/kg（環(huán)丙沙星），食品安全指數(shù)均值為0.000 7，食品安全狀態(tài)較好。[結論]該方法靈敏度較高、分析時間較短、回收率較高，可以定量檢測養(yǎng)殖水體和養(yǎng)殖生物體中喹諾酮類藥物殘留。

關鍵詞?喹諾酮;養(yǎng)殖水體;中華鱉;藥物殘留;食品安全指數(shù);固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法

中圖分類號?TS254.7?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0181-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.049

Abstract?[Objective]A method for simultaneous detection of 6 kinds of quinolone in environmental water samples and aquatic products samples by using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed.[Method]The volume of water sample which was needed was small，and aquatic products samples were extracted with the mixture of acetonitrile， water and DMSO. The residue of 6 kinds of quinolone antibiotics in water in aquafarm and Trionyx sinensis in an area of Zhejiang Province was measured.[Result]2 antibiotics were detected in water samples with maximum concentrations of 421.06 ng/L（enrofloxacin），54.20 ng/L（ciprofloxacin）.4 antibiotics were detected in Trionyx sinensis with maximum concentrations of 3.98 μg/kg（ofloxacin），3.22 μg/kg （pefloxacin），127.44 μg/kg（enrofloxacin），65.00 μg/kg（ciprofloxacin）. The average number of IFS of Trionyx sinensis was 0.000 7， which was acceptable. [Conclusion]This method has high sensitivity， short analysis time and high recovery rate， and can quantitatively detect quinolone drug residues in aquaculture water and aquaculture organisms.

Key words?Quinolone;Aquaculture water;Trionyx sinensis;Drug residues;IFS;Solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

抗生素能有效預防和治療疾病，并有一定的促進生長的作用，被廣泛地用于醫(yī)藥、畜禽水產(chǎn)的養(yǎng)殖業(yè)中。我國作為人口大國和養(yǎng)殖業(yè)大國，抗生素使用量巨大。2013年中國科學院廣州地球化學研究所發(fā)布了全國抗生素污染地圖，調查估算一年有超過5萬t抗生素排放進水土環(huán)境中，其中46.1%由養(yǎng)殖業(yè)引起[1]，浙江屬于較為嚴重的抗生物污染地區(qū)。

喹諾酮是一類人工合成的廣譜類抗菌藥，通過抑制細菌的DNA解旋酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ）和拓撲異構酶Ⅳ（topoisomerase Ⅳ）而影響細菌的DNA復制、轉錄、修復和細胞壁的染色體分裂過程，從而使細菌失活，對革蘭氏陽性菌等菌株有良好的抗菌效果，是現(xiàn)階段大量使用的一類抗生素[2-3]。由于其具有服用吸收好、抗菌譜廣、半衰期較長、價格相對低廉等突出優(yōu)勢，在包括中國以內(nèi)的許多國家和地區(qū)，喹諾酮已經(jīng)成為在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面最常用的藥物之一。雖然喹諾酮藥物在細菌耐藥性和多重耐藥性問題上，從第1代到第4代上有了很大的改善，其使用安全性也隨著藥效動力學和細胞毒性等方面的改良而顯著提高[4]，但是隨著水產(chǎn)行業(yè)集約化發(fā)展、高密度養(yǎng)殖，各種細菌性和真菌性等魚病頻發(fā)，漁民違規(guī)、超量、濫用喹諾酮藥物，因其施藥后，僅少部分被機體吸收，大部分喹諾酮被排泄到水體，或沉降到沉積物中，仍會引發(fā)細菌耐藥性不斷增強的問題，也對環(huán)境造成污染，最終影響人體健康[5]。

目前，市場上流通的藥品以氟喹諾酮類抗生素為主，如環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星等，隨著對氟喹諾酮類藥物在環(huán)境和生物體中殘留和風險評估等研究不斷深入，不少藥物已經(jīng)逐步被我國和其他國家歸為獸用禁藥。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》（農(nóng)業(yè)部公告第193號）、《動物性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部公告第235號）、《農(nóng)業(yè)部決定在食品動物中停止使用洛美沙星等4種獸藥》（農(nóng)業(yè)部公告第2292號）等文件中對諾氟沙星等藥物和物質作出了規(guī)定。因此該研究建立了養(yǎng)殖水體和養(yǎng)殖水產(chǎn)品中6種最常見的喹諾酮藥物超高效液相色譜-質譜聯(lián)用檢測分析方法，有助于進一步分析浙江省養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖中華鱉以及其他水產(chǎn)品喹諾酮的含量和分布情況，并檢測分析了浙江省某地區(qū)中華鱉養(yǎng)殖場養(yǎng)殖水體和中華鱉的喹諾酮殘留。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑?Waters Xevo TQ-S 三重四級桿質譜儀、氮吹儀。

恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、培氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星，純度≥95%（Dr.Ehrenstorfer）;Oasis HLB 固相萃取小柱（ 500 mg/6 mL），購于美國Waters 公司;甲醇、乙腈為色譜純，購于上海安譜公司。

1.2?樣品采集?2019年9—12月采集浙江省某地區(qū)20個中華鱉養(yǎng)殖場水質樣品20個，20個中華鱉樣品。樣品于24 h內(nèi)帶回實驗室處理，水質樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用，中華鱉取其肌肉組織均質備用。

1.3?樣品前處理

1.3.1?水樣提取。水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，量取40.0 mL，加入10.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液混合均勻，以1～2滴/s的速度過HLB固相萃取柱（不需要活化），待試樣完全流出后，用3.0 mL去離子水淋洗，減壓抽干，用6.0 mL甲醇溶液洗脫。將洗脫液在40 ℃下，氮吹濃縮至近干，用1.00 mL 10%的甲醇水溶液溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待上機測定分析。

1.3.2?生物樣提取。稱取1.0 g（精確到0.01 g）中華鱉樣品至50 mL塑料離心管，加入2.0 mL H2O，再加入8.0 mL含2%DMSO的乙腈水溶液，振蕩提取5 min，在4 ℃下5 000 r/min離心5 min，取其上清液。

1.3.3?凈化。取3.0 mL提取液，于15 mL離心管中，加入3.0 mL乙腈溶液，混合均勻，4 ℃下5 000 r/min離心5 min。以1～2滴/s的速度過HLB固相萃取柱（不需要活化），棄去初始2.0 mL流出液體，收集剩余流出液于另一干凈15 mL離心管，氮吹濃縮至近干，用純水定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待上機測定分析。

1.4?儀器條件

1.4.1?色譜條件。

色譜柱為waters BEH?C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫40 ℃;進樣量3.0 μL;流速0.25 mL/min;流動相為甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）;洗脫程序為0～0.3 min，10%A;0.3～3.5 min，10%～70%A;3.5～3.7 min，70%A;3.7～4.0 min，70%～10%A;4.0～6.0 min，10%A。

1.4.2?質譜條件。離子源：電噴霧離子源;柱溫：40 ℃;通過多反應監(jiān)測（MRM）進行數(shù)據(jù)采集，離子模式：ES+，毛細管電壓為1.5 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑氣溫度600 ℃;去溶劑流速：1 000 L/h;錐孔流速：0.15 mL/min。6種喹諾酮類質譜參數(shù)如表1所示。

1.5?食品安全指數(shù)（IFS）

IFS遠小于1時，表明該物質對食品安全沒有影響;IFS≤1，表明該物質對食品安全的風險是可以接受的;IFS>1，表明該物質對食品安全影響的風險超過了可以接受的限度，需要進入風險管理[6-7]。

IFS=R×FSI×bw

其中，IFS為食品安全指數(shù);R為藥物殘留濃度（μg/kg）;F為食品消費量（kg/d）;SI為安全攝入量，用ADI代入計算;

bw為體重，取60 kg計算。

2?結果與分析

2.1?色譜條件優(yōu)化

盡管乙腈作為流動相的有機相部分，系統(tǒng)壓力比甲醇低，但是大多數(shù)化合物在甲醇中獲得比在乙腈中更強的響應，而且甲醇毒性比乙腈小，故流動相有機相部分選擇甲醇。

對比流動相水相部分添加甲酸、乙酸銨和不添加3種情況， 0.1%甲酸峰型效果好。

如圖1、2，流動相分別為甲醇和0.1%甲酸水溶液、乙腈和0.1%甲酸水溶液、甲酸和去離子水、乙腈和去離子水。圖1中總離子圖中流動相為甲醇和0.1%甲酸水溶液、乙腈和0.1%甲酸水溶液的峰型較好，但是在圖2中單個組分上，流動相有機相為甲醇的峰型更好，基線更平穩(wěn)，而且乙腈為流動相，有雜峰。所以選擇流動相為甲醇和0.1%甲酸水溶液。

2.2?前處理條件優(yōu)化

為水質樣品獲得較高的回收率，考察了甲醇、乙腈、丙酮3種洗脫劑對0.1、0.5和1.0 μg/L的加標濃度水平下6種喹諾酮藥品回收率的影響。結果顯示，乙腈、丙酮洗脫6種藥物在3種不同加標濃度下的回收率較低，而甲醇洗脫3種不同加標濃度的樣品回收率在61%～120%，故選擇甲醇作為水質樣品的洗脫劑。

生物樣提取中第一步中用含有DMSO的乙腈水溶液，是因為多數(shù)獸藥為極性化合物或弱極性化合物，增加了樣品中水含量，而DMSO具有增加多種獸藥在乙腈中溶解度的作用，以提高回收率[8]。提取液合并后，其有機相比例為80%，盡管大部分蛋白質和脂肪被分離，提取液中還是存在水溶性基質和鹽分，取3.0 mL提取液，加入3.0 mL乙腈溶液混合均勻，將有機相比例提升至90%，剩余大部分的水溶性基質和鹽分通過離心沉淀，因為蛋白質、鹽分等在高濃度的乙腈中溶解度顯著降低。

2.3?樣品加標回收率

水質樣品以外標法進行測定，取空白樣品40 mL，添加3個不同濃度水平的混合標準溶液配制成0.1、0.5和1.0 μg/L的濃度，生物體取空白樣品1 g，用內(nèi)標法加入10和20 ng混合標準品，計算平均回收率及相對標準偏差（RSD）。結果發(fā)現(xiàn)（表2），水質樣品中6種喹諾酮的加標回收率為61.4%～120.6%，RSD為1.2%～16.9%;生物體中6種喹諾酮的加標回收率為73.3%～113.7%，RSD為0.8%～7.6%。

2.4?工作曲線線性范圍和方法檢出限?按“2.1”優(yōu)化的色譜條件進樣，6種喹諾酮藥物在0.5～10.0 μg/L具有良好的線性關系，其相關系數(shù)（r）均大于0.99。以信噪比（S/N）≥10對應濃度為依據(jù)估算儀器的檢出限，結果發(fā)現(xiàn)（表2），水質樣品和生物體中6種喹諾酮的檢出限分別為0.6～9.1 ng/L、0.04～0.71 μg/kg。

2.5?實際樣品中喹諾酮的含量?該試驗中于浙江省某地20個中華鱉養(yǎng)殖場采集的20個水質樣品和20個中華鱉樣品，用所建立的分析方法進行目標喹諾酮的分析。結果顯示，部分水樣中檢出恩諾沙星、環(huán)丙沙星，其中2批次檢出恩諾沙星，檢出濃度為0.27～10.50 μg/L，1批次檢出環(huán)丙沙星，檢出濃度為1.36 μg/L;部分中華鱉樣品中檢出氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和培氟沙星，其中6批次檢出氧氟沙星，檢出濃度在0.79～3.98 μg/kg，1批次檢出培氟沙星，檢出濃度為3.22 μg/kg，7批次檢出恩諾沙星，檢出濃度為1.70～127.44 μg/kg，8批次檢出環(huán)丙沙星，檢出濃度為1.87～65.00 μg/kg。

3?討論

3.1?水質樣品中喹諾酮藥物的殘留狀況

結果顯示，浙江省該地區(qū)20個中華鱉養(yǎng)殖場水體喹諾酮殘留不太嚴重。與其他研究相比，李佩佩等[9]檢測溫州和舟山的10個養(yǎng)殖廠水體，一批次檢出環(huán)丙沙星，檢出濃度為0.01 μg/L;趙東豪等[10]檢測廣東省水產(chǎn)養(yǎng)殖場養(yǎng)殖水10份，其中3份水樣檢出了恩諾沙星、環(huán)丙沙星，檢出濃度為117～376 ng/L，情況比較一致。養(yǎng)殖場水質樣品中檢出率不高，可能是因為在喹諾酮類藥物在水體中轉移能力較強，會隨著時間推移，沉降富集到底層沉積物上，同時養(yǎng)殖場會定時換水，部分藥物殘留經(jīng)水體交換排放出去。

3.2?中華鱉樣品中喹諾酮藥物的殘留狀況

浙江省該地區(qū)20個中華鱉養(yǎng)殖場采集的中華鱉樣品檢出率較高，目前，市場上水產(chǎn)品喹諾酮類藥物檢出情況也比較多。2020年浙江省市場監(jiān)督管理局公布的2020年第7期食品安全監(jiān)督抽檢信息通告中，4批次的大黃魚和黑魚中氧氟沙星不合格[11]。2019年12月，溫州市市場監(jiān)督管理局開展的日常食品安全監(jiān)督抽檢有關情況通報中，檢出黑魚氧氟沙星23.9 μg/kg，花螺恩諾沙星和環(huán)丙沙星總和233.0 μg/kg[12]。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部第235號公告，恩諾沙星的每日允許攝取量（acceptable daily intake，ADI）為2 μg/kg[13]，由于恩諾沙星在生物體內(nèi)會轉化成環(huán)丙沙星，按其總量計算。據(jù)不完全統(tǒng)計，2013年浙江省甲魚銷售量約為11.2萬t[14]，浙江省人口約為5 500萬人，估算得平均每人每天消費5.58 g。該試驗中，恩諾沙星和環(huán)丙沙星之和濃度為0～192.44 μg/kg，均值為15.55 μg/kg，則食品安全指數(shù)（IFS）均值為0.000 7，最大值為0.008 9，遠低于1。其他4種喹諾酮沒有設定ADI值，不予計算。

4?結論

（1）該試驗中，水質檢測方法取樣量少，生物檢測方法利用乙腈和水作為提取液，并添加了DMSO，增進了目標物在乙腈中的溶解度從而提高回收率，而且兩者其凈化過程簡單方便。該方法靈敏度較高、分析時間較短、回收率較高，可以定量檢測養(yǎng)殖水體和養(yǎng)殖生物體中喹諾酮類藥物殘留，為進一步監(jiān)測浙江省典型養(yǎng)殖環(huán)境中水體喹諾酮類物質分布以及分析生物體喹諾酮類物質殘留聚集和代謝提供技術支持。

（2）該試驗中20份水樣和20份中華鱉樣品的6種喹諾酮藥物殘留結果表明，養(yǎng)殖水中，喹諾酮類藥物不容易富集。中華鱉中檢出率較高，IFS遠小于1，其食品安全狀態(tài)可以接受。但是采用的消費量水平數(shù)據(jù)，是根據(jù)全省消費量和人口數(shù)據(jù)計算，數(shù)據(jù)有一定的局限性和誤差性。特定地區(qū)單一食品膳食攝入量的缺失，是當前制約食品風險評估的主要瓶頸問題。因此，開展特定地區(qū)膳食攝入量調查，對該地區(qū)開展食品安全評價有重要意義。

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