超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)苦蕎中10種真菌毒素

唐振濤 于剛 劉菲 俞凌云 薛康

摘要?[目的]建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)苦蕎樣品中10種真菌毒素。[方法]苦蕎樣品經(jīng)水和乙腈提取后，采用QuEChERS方法凈化。通過超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下進(jìn)行目標(biāo)真菌毒素的分析。試驗(yàn)對(duì)樣品前處理、儀器分析條件進(jìn)行優(yōu)化;考察方法的基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、精密度、回收率等參數(shù)。[結(jié)果]根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果，50%的目標(biāo)真菌毒素具有顯著的信號(hào)抑制/增強(qiáng)效應(yīng)。為了補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的影響，選用基質(zhì)配標(biāo)法進(jìn)行目標(biāo)真菌毒素的分析。方法的線性范圍為0.5～50.0 μg/L（對(duì)于黃曲霉毒素B2、G2，線性范圍為0.125～12.500 μg/L），檢出限和定量限分別低至0.011和0.040 μg/L，回收率為89.70%～105.83%，RSD<9%（n=6）。[結(jié)論]建立的方法簡(jiǎn)便、可靠，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性，能有效用于苦蕎樣品中多組分真菌毒素的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞?苦蕎;多組分真菌毒素;QuEChERS;超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜

中圖分類號(hào)?TS211.7?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2021）01-0188-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.051

Abstract?[Objective]To establish an analysis method for simultaneous determination of 10 mycotoxins in buckwheat samples based on QuEChERS-ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.[Method]As a typical run，mycotoxins were extracted with water and acetonitrile，followed by purification with QuEChERS procedure.The target mycotoxins were analyzed by UPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） mode.The sample pretreatment and instrumental analysis method were respectively optimized.Finally，matrix effect，detection limits，precision and accuracy were investigated.[Result]According to the investigation of matrix effect，50% of the target mycotoxins have encountered prominent signal suppression / enhancement.To compensate the significant matrix effect，matrix-matched calibration curves were finally employed in this study.The linear range of targets were 0.5-50.0 μg/L （0.125-12.500 μg/L for AFB2，AFG2）.Detection limits （LOD） and quantification limits （LOQ） were respectively detected down to 0.011 and 0.040 μg/L.Recoveries were obtained ranging from 89.70% to 105.83% with RSD< 9%.[Conclusion]The established method exhibits several advantages of simplicity，reliability，good sensitivity and accuracy.It is feasible and effective to apply this method for determination of multi-mycotoxins in buckwheat samples.

Key words?Buckwheat;Multi-mycotoxins;QuEChERS;UPLC-MS/MS

苦蕎是蓼科蕎麥屬植物，在我國(guó)西南、中南、華北等地均有分布。該類植物能適應(yīng)環(huán)境惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境，主要作為糧食和飼料供人們使用。苦蕎含有優(yōu)于小麥、玉米等的蛋白質(zhì)及氨基酸，還含有大量維生素和多種礦質(zhì)元素，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。另一方面，苦蕎富含黃酮類、甾體類、多糖等生物活性成分;藥理學(xué)研究表明苦蕎具有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化、預(yù)防心血管疾病等作用[2-4]。隨著苦蕎藥理作用的研究發(fā)現(xiàn)，“藥食同源”的苦蕎及其產(chǎn)品迎來(lái)廣闊的市場(chǎng)前景，有關(guān)苦蕎產(chǎn)品的開發(fā)利用也得到越來(lái)越多的關(guān)注[5]。然而，與其他谷物一樣，苦蕎面臨著易被真菌毒素污染的難題[6]。真菌毒素污染不僅會(huì)對(duì)人體健康造成巨大危害，還將嚴(yán)重影響苦蕎及其制品的經(jīng)濟(jì)效益[7]。目前有關(guān)苦蕎中真菌毒素的研究還比較少，尤其是多組分真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)[6]。

食品中真菌毒素的檢測(cè)方法有很多，包括高效液相色譜法、薄層色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等[8-9]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是最常用的檢測(cè)方法[10-12]。該方法可以實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)，靈敏度高，能提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，具有更高的可靠性。作為復(fù)雜基質(zhì)中多組分真菌毒素的關(guān)鍵步驟，簡(jiǎn)單、高效、低成本的樣品前處理方法能進(jìn)一步提高分析的準(zhǔn)確性和實(shí)用性[13]。QuEChERS法因其簡(jiǎn)便、有效、溶劑用量少被廣泛用于食品中農(nóng)藥殘留的提取凈化[14]。近年來(lái)，已逐漸被用于食品中真菌毒素的前處理并取得一定進(jìn)展[10，15]。由于苦蕎基質(zhì)復(fù)雜，而真菌毒素常以痕量存在，該研究選擇結(jié)合QuEChERS法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了簡(jiǎn)便、有效的分析方法，有利于實(shí)現(xiàn)苦蕎樣品中多組分真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

10種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B2，T-2毒素，HT-2毒素，赭曲霉毒素A，柄曲霉素，純度95.0%～98.9%，奧地利Biopure公司;甲醇、乙腈，HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司;甲酸、乙酸銨，MS級(jí)，德國(guó)Sigma公司;無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉，分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司;尼龍針式濾頭（0.22 μm），天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;凈化材料（PSA、GCB、C18、Al2O3），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;氧化石墨烯，自制。

1.2?儀器與設(shè)備?超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜（Acquity Xevo TQ-XS，美國(guó)Waters公司）;C18色譜柱（50 mm×2.1 mm×2.7 μm，美國(guó)Waters公司）;電子分析天平（XS205DU，梅特勒-托利多儀器有限公司）;渦旋混合器（XW-80A，上海滬西分析儀器有限公司）;純水機(jī)（Milli-Q integral 3，美國(guó)MILLIPORE公司）;離心機(jī)（3K30，德國(guó)Sigma公司）;高速粉碎機(jī)（德國(guó)IKA公司）。

1.3?樣品前處理

1.3.1?樣品制備。由成都海關(guān)技術(shù)中心理化實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)提供15個(gè)苦蕎樣品。樣品用高速粉碎機(jī)粉碎，過篩;混合均勻后縮分至500 g，密封保存于4 ℃以下，供檢測(cè)用。

1.3.2?樣品提取。取2 g（精確至0.01 g）樣品粉末于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水將其浸沒。然后加入10 mL乙腈，渦旋混勻，搖床振蕩30 min。提取后以10 000 r/min的速度離心，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中?？焖偌尤? g無(wú)水MgSO4和1 g NaCl，并渦旋3 min。再次離心，取上清液備用。

1.3.3?樣品凈化。準(zhǔn)確移取2 mL提取液，加入30 mg C18，渦旋1 min后離心。將1 mL上清液在40 ℃下用氮?dú)饩徛抵两?，加? mL初始流動(dòng)相，繼續(xù)渦旋1 min。最后用0.22 μm濾膜過濾待測(cè)液，收集至進(jìn)樣瓶，備用。

1.4?儀器分析條件

1.4.1?色譜條件。流動(dòng)相：0.1%甲酸水+5 mmol/L乙酸銨（A相），0.1%甲酸甲醇+5 mmol/L乙酸銨（B相）;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：2 μL;梯度洗脫程序見表1。

1.4.2?質(zhì)譜條件。

質(zhì)譜配備電噴霧離子源（150 ℃，正離子模式ESI+）;檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）;錐孔氣流速：150 L/h;脫溶劑氣溫度及流速：250 ℃，800 L/h;目標(biāo)化合物物的采集參數(shù)（包括離子對(duì)、碰撞電壓、錐孔電壓）見表2。

2?結(jié)果與分析

2.1?提取溶劑的優(yōu)化

由于去離子水能促進(jìn)真菌毒素從樣品基質(zhì)釋放出來(lái)，真菌毒素的提取過程中首先加入10 mL去離子水浸泡樣品。在此基礎(chǔ)上，3種提取溶劑被用于樣品基質(zhì)中10種真菌毒素的提取，包括①10 mL去離子水，10 mL甲醇;②10 mL去離子水，10 mL乙腈;③10 mL去離子水，10 mL 1%甲酸乙腈。試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇有機(jī)相不能通過加入無(wú)機(jī)鹽與水相分離。另一方面，第3種提取溶劑會(huì)導(dǎo)致伏馬毒素B2的回收率異常高。而采用第2種提取溶劑時(shí)，真菌毒素的萃取效率和回收率均能得到較為滿意的結(jié)果。因此，最終選擇10 mL去離子水、10 mL乙腈為提取溶劑。

2.2?凈化材料的優(yōu)化

為了降低共提取化合物的干擾，試驗(yàn)測(cè)試了多種類型的凈化材料，包括N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、磁性氧化石墨烯（MGO）、C18和Al2O3。為了比較不同材料的凈化能力，進(jìn)行了6組平行試驗(yàn)，包括未凈化的提取溶液。由表3可見，對(duì)于PSA材料，伏馬毒素B2沒有回收率，這可能是因?yàn)镻SA含有氨基官能團(tuán)，能與含羧基基團(tuán)的化合物發(fā)生化學(xué)吸附。相似地，與未凈化的提取溶液相比，含有羧基基團(tuán)的赭曲霉毒素A的回收率也較低。對(duì)于吸附能力較強(qiáng)的GCB，柄曲霉素和HT-2毒素的回收率有所降低，而黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的回收率更低。對(duì)于MGO，伏馬毒素B2同樣沒有回收率，這可能是由材料的氫鍵吸附造成。另一方面，比較MGO和未凈化提取溶液的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者具有相似的目標(biāo)物回收率。說明MGO對(duì)苦蕎樣品中干擾物的凈化能力比較有限。Al2O3的堿性性質(zhì)造成伏馬毒素B2沒有回收率，而赭曲霉毒素A的回收率有所降低。相比之下，通過C18凈化的目標(biāo)物的回收率有所改善（75.18%～127.32%），它能降低樣品基質(zhì)的干擾，同時(shí)不對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生不必要的吸附。因此，最終選擇C18作為凈化材料。

2.3?基質(zhì)效應(yīng)的考察

通過基質(zhì)配標(biāo)校準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑配標(biāo)校準(zhǔn)曲線的斜率百分比值定義方法的基質(zhì)效應(yīng)（信號(hào)增強(qiáng)或抑制，SSE），結(jié)果見表4。該比值代表了干擾物對(duì)目標(biāo)分析物離子化效率的影響。從表4可以看出，黃曲霉毒素G1、G2，T-2毒素，赭曲霉毒素A的基質(zhì)效應(yīng)尚在可接受范圍（80%～120%）。黃曲霉毒素B2和伏馬毒素B2則具有顯著的信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)（SSE值>100%），而其他4種真菌毒素（黃曲霉毒素B1、柄曲霉毒、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素）具有25%～40%的信號(hào)抑制效應(yīng)（SSE值<100%）。

根據(jù)考察結(jié)果，50%的目標(biāo)真菌毒素具有顯著的基質(zhì)效應(yīng)。為了補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的影響，選用基質(zhì)配標(biāo)法進(jìn)行目標(biāo)分析物的定量分析?；|(zhì)匹配目標(biāo)分析物的MRM色譜圖如圖1所示。

2.4?線性關(guān)系、檢出限和定量限的考察

采用不含真菌毒素的苦蕎樣品，按建立的樣品預(yù)處理方法制備空白基質(zhì)溶液。通過在空白基質(zhì)液中加入相應(yīng)量的真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品，配制基質(zhì)匹配的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5～50.0 μg/L，對(duì)于黃曲霉毒素B2、G2，濃度范圍為0.125～12.500 μg/L）。以目標(biāo)化合物的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)、溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。方法的回歸方程、決定系數(shù)、線性范圍見表5。方法的檢出限（3倍信噪比）及定量限（10倍信噪比）通過線性方程中最低濃度點(diǎn)計(jì)算得到。

由表5可見，決定系數(shù)（R2）均不小于0.994 0，表明校正曲線在0.125～50.000 μg/L具有較好的線性關(guān)系。10種真菌毒素的檢出限（0.011～0.241 μg/L）及定量限（0.040～0.804 μg/L）表明方法具有較好的定性和定量分析能力。從另一方面來(lái)看，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的檢測(cè)能力均能滿足多個(gè)國(guó)家對(duì)谷物中這3類真菌毒素的監(jiān)管要求（表6）。而其他7種真菌毒素目前暫無(wú)谷物的限量規(guī)定。

2.5?回收率和重現(xiàn)性試驗(yàn)

在12份空白樣品中分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到2個(gè)濃度級(jí)別的6份平行加標(biāo)樣（2和10 μg/L，對(duì)于黃曲霉毒素B2、G2，濃度分別為0.5和2.5 μg/L）。按上述方法制備樣品并進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各真菌毒素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明（表7），平均回收率為89.70%～105.83%，RSD值為0.82%～8.45%，符合歐盟No 401/2006條例對(duì)真菌毒素定量分析的性能標(biāo)準(zhǔn)（回收率在70%～110%，RSD<15%）。

2.6?實(shí)際樣品的檢測(cè)

將建立的方法用于15個(gè)隨機(jī)樣品的檢測(cè)分析。對(duì)于實(shí)際樣品分析，采用相對(duì)離子豐度作為額外的定性分析準(zhǔn)則。樣品的檢測(cè)結(jié)果見表8。

從檢測(cè)結(jié)果（表8和圖2）可以看出，46.7%的樣品存在真菌毒素污染。雖然大部分毒素的污染濃度都低于方法的定量限，污染通常伴隨多種類型的真菌毒素。對(duì)于13號(hào)樣品，黃曲霉毒素B1的濃度超過了歐盟的監(jiān)管限量。而其他被檢測(cè)到的柄曲霉素、伏馬毒素B2、T-2毒素、HT-2毒素暫沒有針對(duì)谷物的限量規(guī)定。

3?討論

該研究成功建立了苦蕎基質(zhì)中10種不同真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法簡(jiǎn)單可靠、靈敏有效，適合大批量樣品的高通量分析。從實(shí)際苦蕎樣品的分析得到以下結(jié)論：①該方法用于苦蕎樣品中多種真菌毒素的檢測(cè)分析是切實(shí)可行的;②應(yīng)探究更多種類的真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)方法;③由于真菌毒素污染通常伴隨多種類型的真菌毒素，多組分真菌毒素的污染監(jiān)管是很有必要的。

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