康 超，郝 督，簡思杰，榮 娜，劉 祥*，丁 銳

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 中德天然產(chǎn)物研究所， 陜西 漢中 723000；2.甘肅新希望六和農(nóng)牧有限公司， 甘肅 蘭州 730000)

3-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯乙酸是3種重要的化工中間體，廣泛用于醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥等領(lǐng)域[1]。其中，4-羥基苯乙酸被認(rèn)為是一種潛在的高滲、缺氧的抑制劑[2]，具有抗焦慮[3]、抑菌和防治肺水腫活性特性[4]。3-羥基苯乙酸和3,4-二羥基苯乙酸是神經(jīng)遞質(zhì)的內(nèi)源性代謝物[5]，經(jīng)小鼠靜脈注射后均表現(xiàn)出抗焦慮活性。細(xì)胞色素P450酶系是代謝內(nèi)源性(激素)和外源性化合物(藥物、農(nóng)藥)的混合功能氧化酶，是肝臟重要的Ⅰ相代謝酶系，引起人體一系列的藥代動(dòng)力學(xué)變化，負(fù)責(zé)90%藥物的代謝和多種外源化合物的代謝，可用作藥物之間相互作用的預(yù)測[6-8]。因此CYP450酶常用于藥物代謝情況的評(píng)價(jià)。

本研究應(yīng)用大鼠肝微粒體孵育法和Cocktail探針法，與美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)推薦的探針底物[9]非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睪酮在體外孵育后，利用液相色譜技術(shù)評(píng)價(jià)不同羥基位點(diǎn)苯乙酸對(duì)大鼠主要的CYP450酶系4種亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的體外抑制作用，以期探討不同羥基位點(diǎn)苯乙酸的代謝差異，為新藥合成奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

3-羥基苯乙酸(貨號(hào)B24111)、4-羥基苯乙酸(貨號(hào)B30104)和3,4-二羥基苯乙酸(貨號(hào)B21788)，均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海源葉生物科技公司，HPLC純度≥98%；非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睪酮(上海源葉生物科技公司，純度≥98%)；還原輔酶Ⅱ四鈉鹽(NADPH，批號(hào)S10103)、色譜甲醇、色譜乙腈(純度≥99.5%)均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；改良型BCA測蛋白濃度試劑盒(上海生工有限公司)、冰乙酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀含自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、低壓四元梯度泵、DAD檢測器(thermo)；Intersil? ODS-3(日本島津)；ME104E/02型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；DW-86L388L超低溫冷凍冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；1730R微量高速冷凍離心機(jī)(韓國基因有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州潤華電器有限公司)；全自動(dòng)雪花制冰機(jī)(日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)；KQ3200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；溶劑過濾器(天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康8周齡雄性SD大鼠3只，體重(200±10) g(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格編號(hào)SCXK(陜)2018-001)，為SPF級(jí)動(dòng)物。將大鼠飼養(yǎng)在22 ℃、濕度70%、12 h明暗交替環(huán)境下，允許自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)5 d以上，保證充分適應(yīng)環(huán)境。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肝微粒體的制備及濃度測定

雄性SD大鼠，12 h明暗交替，實(shí)驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)5 d以上。取樣前12 h禁食不禁水，將大鼠脫頸處死，剖腹后摘取肝臟，用已預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，用剪刀剪碎。稱取肝臟組織，加入質(zhì)量比為1∶9的生理鹽水，3000 r/min冰浴勻漿20 s，4 ℃條件9000 r/min離心20 min，上清液轉(zhuǎn)移至含0.2 mL CaCl2(88 mmol)溶液的離心管中，冰浴振搖5 min，27 000g離心20 min。在沉淀中加入400 μL甘油-Tris緩沖液，吹打混勻，于-80 ℃冰箱保存。用BCA法測定所制備的微粒體蛋白濃度，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，OD562 nm下測定樣品吸光度。以A562吸光值為縱坐標(biāo)，BSA濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得肝微粒體蛋白濃度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、非那西丁、睪酮標(biāo)準(zhǔn)品11.4、9.2、10.4、9.3 mg，以色譜甲醇定容于10 mL容量瓶，渦旋混勻，配成1.14、0.92、1.04、0.93 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。配制4組質(zhì)量濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00、125.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后上HPLC，以探針底物濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，不同濃度下所測得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及肝微粒體孵育體系

實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組(3-羥基苯乙酸組、4-羥基苯乙酸組、3,4-二羥基苯乙酸組)、空白對(duì)照組(無藥物)和無活性組(無NADPH)，每組實(shí)驗(yàn)平行3樣本。精密稱取3-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品20.14、16.27、12.65 mg溶于甲醇配制濃度為1 mg/mL的母液。以Tirl-HCl(100 mmol/L，pH 7.4)為溶劑稀釋，制得終濃度為5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/mL的3-羥基苯乙酸、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯乙酸溶液。如表1所示為孵育體系，體系在37 ℃恒溫水浴中預(yù)孵育5 min后快速加入30 μL的NADPH溶液啟動(dòng)反應(yīng)。30 min后立即加入500 μL冰冷甲醇溶液終止反應(yīng)，4 ℃環(huán)境沉淀蛋白3 h，渦旋振蕩1 min，14 000 r/min離心15 min，取上清液，20 μm有機(jī)濾膜過濾上清液上HPLC。

2.4 高效液相色譜檢測方法

Intersil? ODS-3(4.6 mm×150 mm，4 μm)；流速：0.75 mL/min；流動(dòng)相：流動(dòng)相(A)乙腈，流動(dòng)相(B)25 mM乙酸鈉緩沖液；檢測波長范圍：200～350 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；采用梯度洗脫，其程序如表2所示。

表1 大鼠肝微粒體孵育體系加樣表

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.5 相對(duì)酶活性計(jì)算

通過建立的探針?biāo)幬锓z測物中探針底物的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算底物濃度(無活性組測定值為總底物濃度)代入公式計(jì)算相對(duì)酶活性：

相對(duì)酶活性=(總底物濃度-剩余底物濃度)/總底物濃度×100%。

2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel、SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，連續(xù)型變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，實(shí)驗(yàn)組和空白組采用單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 BCA法蛋白濃度測定

利用BCA法測定制備好的大鼠肝微粒體蛋白濃度，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，在波長為562 nm處測定樣品的吸光度。以BSA的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，A562吸光值為縱坐標(biāo)，所得線性回歸方程為y=0.001 4x+0.127 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到檢測要求，計(jì)算獲得大鼠肝微粒體蛋白濃度為0.4 mg/mL。

3.2 探針?biāo)幬锏臉?biāo)準(zhǔn)曲線

以非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、睪酮樣品的濃度為橫坐標(biāo)，各探針?biāo)幬锏姆迕娣e為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表3所示。標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖如圖1所示，表明各物質(zhì)峰形良好，分離完全，無雜質(zhì)峰干擾，出峰時(shí)間分別為12.180、13.057、13.353、16.013 min，在濃度范圍內(nèi)，各探針?biāo)幬锓迕娣e與濃度均呈良好的線性關(guān)系。

表3 大鼠肝微粒體中CYP450酶探針底物的回歸方程

A.非那西?。籅.氯唑沙宗；C.甲苯磺丁脲；D.睪酮 圖1 各探針?biāo)幬锏纳V圖

3.3 CYP450酶系代謝底物剩余濃度

將各組測定的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各探針?biāo)幬锏牡孜锸Ｓ酀舛?，如?—表6所示。

表4 3-羥基苯乙酸存在下大鼠肝微粒體中CYP450酶底物的剩余濃度(x±SD，n=3)

表5 4-羥基苯乙酸存在下大鼠肝微粒體中CYP450酶底物的剩余濃度(x±SD，n=3)

表6 3,4-二羥基苯乙酸存在下大鼠肝微粒體中CYP450酶底物的剩余濃度(x±SD，n=3)

3.4 CYP450酶系的相對(duì)活性

計(jì)算各組藥物的相對(duì)酶活性，結(jié)果如表7—表9所示。由表中數(shù)據(jù)得出3-羥基位點(diǎn)苯乙酸在中高濃度時(shí)，大鼠肝微粒體中的CYP1A2、CYP2E1和CYP2C9的酶活性相對(duì)于空白組有顯著性差異；其濃度在50 μg/mL時(shí)，肝微粒體CYP3A4的酶活性有顯著性差異。4-羥基苯乙酸在不同濃度時(shí)肝微粒體CYP2C9的酶活性有顯著差異，在高濃度CYP2E1和低濃度CYP3A4的酶活性有顯著性差異。3,4-二羥基苯乙酸在不同濃度時(shí)，肝微粒體CYP2C9和CYP2E1的酶活性有顯著差異；在高濃度時(shí)，肝微粒體CYP3A4有顯著性差異；在低濃度時(shí)，肝微粒體CYP1A2和CYP3A4的酶活性有顯著差異。

3.5 探針底物的IC50值及抑制曲線

利用GraphPad Prism 5.0軟件，以相對(duì)酶活性為縱坐標(biāo)，以不同羥基位點(diǎn)苯乙酸濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)作圖，得到不同羥基位點(diǎn)苯乙酸對(duì)CYP450酶系不同亞型的抑制曲線，如圖2—圖4所示。結(jié)果顯示：隨著3-羥基苯乙酸濃度的逐漸升高，CYP2E1與CYP3A4的酶活性均有上升趨勢(shì)，在濃度達(dá)到50 μg/mL后，酶活性到達(dá)最大值，隨后酶活性逐漸降低。4-羥基苯乙酸濃度逐漸增大時(shí)，CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的酶活性變化趨勢(shì)大致相同，在濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的酶活性均到達(dá)最大值，而CYP3A4則是在4-羥基苯乙酸濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)，酶活性到達(dá)最高值；3,4-二羥基苯乙酸的濃度為10 μg/mL時(shí)，4種CYP亞型酶的酶活性均達(dá)到最大。

表7 3-羥基苯乙酸對(duì)大鼠肝微粒體CYP亞型酶相對(duì)活性的影響(x±SD，n=3)

表8 4-羥基苯乙酸對(duì)大鼠肝微粒體CYP亞型酶相對(duì)活性的影響(x±SD，n=3)

表9 3,4-二羥基苯乙酸對(duì)大鼠肝微粒體CYP亞型酶相對(duì)活性的影響(x±SD，n=3)

圖2 3-羥基苯乙酸對(duì)大鼠肝微粒體中 CYP各亞型酶活性的抑制曲線

通過抑制曲線計(jì)算酶活性的IC50值，根據(jù)通用的CYP450酶抑制劑強(qiáng)度分級(jí)規(guī)則進(jìn)行分析[10]，表10結(jié)果顯示IC50值均大于100，即不同羥基位點(diǎn)苯乙酸對(duì)大鼠肝細(xì)胞色素P450(CYP450)酶4種亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4均無顯著抑制作用。但3,4-二羥基苯乙酸對(duì)考察的CYP450酶系的4種亞型的IC50值比只有單個(gè)羥基位點(diǎn)的3-羥基苯乙酸和4-羥基苯乙酸的數(shù)值更小，表明3,4-二羥基苯乙酸對(duì)4種CYP亞型酶的抑制趨勢(shì)較明顯。

圖3 4-羥基苯乙酸對(duì)大鼠肝微粒體中 圖4 3,4-二羥基苯乙酸對(duì)大鼠肝微粒體中 CYP各亞型酶活性的抑制曲線 CYP各亞型酶活性的抑制曲線

表10 不同羥基位點(diǎn)苯乙酸組對(duì)大鼠肝微粒體各亞型的IC50值

4 討論

近年來，關(guān)于藥物單體對(duì)于CYP450酶系的代謝研究較常見，但是有關(guān)于藥物中間體的報(bào)導(dǎo)很少。具有羥基位點(diǎn)的苯乙酸作為一種精細(xì)化工中間體，因其自身的特殊結(jié)構(gòu)顯示出抗焦慮和肝保護(hù)[11]的生理活性，并可用于合成多種藥物，但它的代謝情況并不清楚。CYP450是藥物代謝主要酶系，藥物在代謝過程中會(huì)對(duì)CYP450的酶活性產(chǎn)生影響，因此可通過檢測CYP450酶活性變化來探究藥物的代謝情況。CYP450酶更可參與到中藥誘導(dǎo)肝毒性的檢測之中，其活性變化可直接用作中藥毒副作用的參考[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3-羥基苯乙酸的濃度逐漸升高時(shí)，CYP2E1和CYP3A4的活性均有上調(diào)，隨后下降。4-羥基苯乙酸與3,4-二羥基乙酸在隨著藥物的濃度升高，4種肝藥酶的總體活性上升趨勢(shì)較為明顯，其中CYP3A4升高趨勢(shì)表現(xiàn)一致。3種不同羥基位點(diǎn)的醫(yī)藥中間體，是同分異構(gòu)體，因此在肝微粒體蛋白的活性曲線具有相似性，可能與其本身的結(jié)構(gòu)相關(guān)。黃彧等[13]對(duì)厚樸酚、和厚樸酚(同分異構(gòu)體)在大鼠肝微粒體中的抑制作用研究中發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)大鼠肝微粒體中的4種亞型酶(CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP2B6)活性均有抑制作用，且隨化合物濃度和預(yù)溫育時(shí)間增加而增加。本研究在相同視角下，表明3種不同羥基位點(diǎn)的醫(yī)藥中間體，在與這4種酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4)代謝的藥物進(jìn)行聯(lián)用時(shí)，不存在相互作用，可為臨床藥物使用提供理論依據(jù)。

HPLC法操作方便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高且成本低。李清等[14]利用HPLC檢測探針底物濃度來評(píng)價(jià)中藥對(duì)肝微粒體CYP450酶活性的影響。本實(shí)驗(yàn)通過HPLC方法對(duì)4種CYP450亞型酶的探針底物進(jìn)行檢測，間接獲得了不同位點(diǎn)的羥基苯乙酸對(duì)CYP450亞型酶的影響。探針?biāo)幬镒鳛镃YP450酶的底物，廣泛用于檢測CYP450酶的活性，間接反映藥物在體內(nèi)的代謝情況。目前，較為成熟的探針?biāo)幬镉新冗蛏匙?、右美沙芬、睪酮、甲苯黃丁脲和奧美拉唑，對(duì)應(yīng)CYP450酶分別為CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19。Liu等[15]和景嫻等[16]通過檢測氯唑沙宗和右美沙芬的底物濃度，分析了CYP2E1和CYP2D6的活性，從而評(píng)價(jià)抗生素聯(lián)用在體內(nèi)引起的肝損傷機(jī)理。肝微粒體是研究細(xì)胞色素P450(CYP450)酶介導(dǎo)的藥物代謝的理想培養(yǎng)基[17]，肝微粒體含有肝臟表達(dá)中所有參與藥物代謝的CYP450酶系，且制備簡單，可長期保存，代謝時(shí)間短，結(jié)果重現(xiàn)性好，方便大量操作，該法普遍應(yīng)用于評(píng)價(jià)藥物代謝[18]。郭艷麗等[19]及張培玉等[20]利用鼠或人肝微粒體模型，研究了中藥成分對(duì)CYP450酶系的影響。

本研究制備了濃度為0.4 mg/mL大鼠肝微粒體開展藥物代謝情況研究，發(fā)現(xiàn)不同羥基位點(diǎn)苯乙酸均對(duì)大鼠肝微粒體的CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A無抑制作用，藥物安全性高，為不同羥基位點(diǎn)苯乙酸藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)，但存在種屬差異性，人源肝微粒的代謝還需進(jìn)一步研究探討。