懷牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指紋圖譜建立及單糖成分含量測定

王小燕 郭常潤 常軍民 陳麗

摘 要 目的：建立懷牛膝多糖的柱前衍生化-高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，測定其主要單糖成分的含量，為懷牛膝飲片的質(zhì)量評價提供參考。方法：以10批不同生產(chǎn)廠家的懷牛膝飲片為樣品，采用水提醇沉法提取其多糖后，以三氟乙酸進行水解，再采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化處理后，進行HPLC分析。色譜柱為Hanbon Hedera C18，柱溫為30 ℃，流速為1.2 mL/min，流動相為乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（梯度洗脫），檢測波長為250 nm，進樣量為20 μL。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）建立10批懷牛膝多糖的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，通過與對照品比對進行共有峰指認，并采用SPSS 25.0軟件進行聚類分析。采用HPLC法對指認的單糖成分進行含量測定。結(jié)果：10批懷牛膝多糖樣品的相似度均大于0.95;共標定了9個共有峰，并指認了其中5個共有峰，分別為無水葡萄糖（峰1）、甘露糖（峰2）、鼠李糖（峰4）、半乳糖醛酸（峰5）、阿拉伯糖（峰7）。聚類分析結(jié)果顯示，編號為S1的樣品單獨為一類，編號為S2、S5、S8和S9的樣品聚為一類，編號為S3、S4、S6、S7和S10的樣品聚為一類。含量測定結(jié)果顯示，10批樣品中無水葡萄糖的含量為6.17～17.55 mg/g、甘露糖的含量為3.31～7.66 mg/g、鼠李糖的含量為38.80～73.97 mg/g、半乳糖醛酸的含量為2.49～8.95 mg/g、阿拉伯糖的含量為11.30～28.58 mg/g。結(jié)論：本研究建立的柱前衍生化-HPLC指紋圖譜及單糖組分的含量測定方法可為懷牛膝飲片質(zhì)量評價提供參考。

關(guān)鍵詞 懷牛膝多糖;單糖;柱前衍生化;高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測定

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）03-0294-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.03.08

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish pre-column derivatization-HPLC fingerprint of polysaccharide from Achyranthes bidentata，and to determine the contents of monosaccharide components，so as to provide reference for quality evaluation of A. bidentata decoction pieces.? METHODS： Taking 10 batches of A. bidentata decoction pieces from different manufacturers as samples， the polysaccharides were extracted by water extraction and alcohol precipitation， hydrolyzed by trifluoroacetic acid， and then derivatized by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone for HPLC analysis. The determination was performed on Hanbon Hedera C18 column with column temperature of 30 ℃ at the flow rate of 1.2 mL/min. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.02 mol/L ammonium acetate solution （gradient elution）. The detection wavelength was set at 250 nm， and sample size was 20 μL. HPLC fingerprint was established and similarity evaluation was performed for 10 batches of A. bidentata polysaccharide by using TCM Chromatogramic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012A edition）. The common peak was identified by comparing with the reference substance，and cluster analysis was performed by using SPSS 25.0 software. The contents of identified monosaccharides were determined by HPLC. RESULTS： The similarity of 10 batches of A. bidentata polysaccharide were all higher than 0.95. Nine common peaks were fixed and a total of 5 common peaks were identified， namely anhydrous glucose （peak 1）， mannose （peak 2）， rhamnose （peak 4）， galacturonic acid （peak 5） and arabinose （peak 7）. Results of cluster analysis showed that S1 sample was classified into one category; S2， S5， S8 and S9 samples were clustered into one category; S3， S4， S6， S7 and S10 samples were clustered into one category. Results of content determination showed that the contents of anhydrous glucose in 10 batches of samples ranged from 6.17 to 17.55 mg/g; those of mannose ranged from 3.31 to 7.66 mg/g; those of rhamnose ranged from 38.80 to 73.97 mg/g; those of galacturonic acid ranged from 2.49 to 8.95 mg/g; those of arabinose ranged from 11.30 to 28.58 mg/g. CONCLUSIONS： Established pre-column derivatization HPLC fingerprints and content determination method can provide reference for quality evaluation of A. bidentata decoction pieces.

KEYWORDS? ?Achyranthes bidentata polysaccharide; Monosaccharide; Pre-column derivatization; HPLC; Fingerprint; Contnet determination

懷牛膝Achyranthes bidentata BI.為常用的大宗中藥材之一，最早出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，以根入藥，主要含有甾酮類、皂苷類、多糖類等化合物[1-2]。據(jù)文獻報道，懷牛膝多糖類組分的毒性低、水溶性好，具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、增強免疫力、保護肝臟等多種藥理活性[3]。而多糖通常由各種相對固定比例的單糖組成[4-5]，因此分析多糖中單糖的組成對于研究多糖質(zhì)量標準和探索多糖結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系等信息具有重要意義[6]。

關(guān)于多糖中單糖組分的分析方法，通常是先用三氟乙酸將多糖水解成單糖，再利用發(fā)光試劑衍生后通過高效液相色譜（HPLC）法進行分離和檢測[7]。而指紋圖譜作為一種可體現(xiàn)中藥化學(xué)成分整體特征的質(zhì)量評價方法，對藥材的全面控制具有重要作用[8]。若將生物大分子多糖經(jīng)衍生化后分析其單糖組成，再結(jié)合指紋圖譜技術(shù)，可以更加全面、整體地評價藥材質(zhì)量[9-10]。筆者查閱文獻后發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)懷牛膝多糖的研究主要集中于總多糖的提取工藝及生物活性[11-14]，而對于其中單糖組成及含量分析的研究尚未見相關(guān)報道。因此，本研究擬建立懷牛膝多糖的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化-高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，分析其單糖組成并測定單糖組分的含量，為懷牛膝飲片的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（包括G1312C型雙元泵、G1329B型檢測器、G1316A型柱溫箱、G1315D型進樣器，美國Agilent公司）、BSA124S型萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、TGL-16型臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、BDHH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋[貝蒂（上海）儀器有限公司]、XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）、BHX型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）、PHS-25型數(shù)顯pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的藥品與試劑主要有無水葡萄糖對照品、D-半乳糖醛酸對照品、鼠李糖對照品、D-甘露糖對照品、L（+）阿拉伯糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110833-201707、140648-201804、111646- 201702、111508-201605、140651-201805，純度均不低于98%），D-葡萄糖醛酸（上海源葉生物科技有限公司，批號1506-200202，純度≥98%）;乙腈為色譜純，乙酸銨、氫氧化鈉、三氟乙酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、PMP、甲醇、氯仿等均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

10批懷牛膝飲片購自南京市各大藥房（來源信息見表1），經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院楊中林教授鑒定為懷牛膝A. bidentata BI.的干燥根。樣品保存于中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥炮制實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 懷牛膝多糖的制備

稱取各批次懷牛膝飲片約10 g，將其粉碎過60目篩，并以80%乙醇為溶劑[料液比1 ∶ 12（g/mL）]在80 ℃水浴中回流提取2次，每次2 h;棄去濾液，濾渣揮干溶劑后稱質(zhì)量，然后繼續(xù)以水為溶劑[料液比1 ∶ 15（g/mL）]在98 ℃水浴中回流提取3次，每次2 h;合并3次水提取液，抽濾，合并濾液后濃縮至50 mL，冷卻。緩慢向濃縮液中加入無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為70%，室溫靜置24 h，抽濾后得沉淀物1;然后將濾液濃縮至50 mL，再次加入無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為80%，室溫下靜置24 h，抽濾得沉淀物2。合并沉淀物1和沉淀物2，用丙酮和無水乙醇交替洗滌，直至洗液變?yōu)闊o色為止，然后干燥除去殘留的洗滌試劑后，得到的沉淀物即為懷牛膝多糖。以D-無水葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法[15]測得10批懷牛膝飲片（編號S1～S10）中多糖的得率分別為18.10%、18.30%、17.56%、10.74%、17.52%、16.08%、15.88%、13.2%、14.8%、16.52%。

2.2 溶液的制備

2.2.1 單糖對照品溶液 稱取D-無水葡萄糖對照品6.87 mg、D-甘露糖對照品5.51 mg、鼠李糖對照品5.70 mg、D-半乳糖醛酸對照品4.66 mg、L（+）阿拉伯糖對照品4.35 mg，置于不同1 mL量瓶中，分別用水溶解并稀釋至刻度，渦旋混勻，即得各單糖的單一對照品溶液。

2.2.2 懷牛膝多糖水解液 精密稱取100 mg懷牛膝多糖至10 mL離心管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液4 mL使溶解，密封后，在110 ℃烘箱中水解4 h;取出，冷卻至常溫，并以3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)水解液的pH至6.5，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 除不加多糖樣品外，其余按“2.2.2”項下方法操作，制得陰性對照溶液。

2.3 衍生化處理及各衍生化溶液制備

精密吸取“2.2.1”項下各單糖對照品溶液、“2.2.2”項下多糖水解液和“2.2.3”項下陰性對照溶液各0.3 mL，置于不同5 mL離心管中，分別加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液300 ?L和0.3 mol/L NaOH溶液300 ?L，渦旋混合，在70 ℃水浴中衍生30 min;待衍生完畢放冷后，加入0.3 mol/L HCl溶液300 ?L終止反應(yīng)。在離心管中加入1 mL氯仿溶液進行萃取，棄去氯仿層，取上層溶液;再如上重復(fù)操作3次，合并上層溶液后以0.35 ?m濾膜濾過，即得到經(jīng)衍生化處理后的各溶液。分別吸取經(jīng)衍生化處理后的各單糖對照品溶液 0.2 mL，充分混合后，經(jīng)0.35 ?m濾膜過濾，收集濾液，即得經(jīng)衍生化處理后的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Hanbon Hedera C18（250 mm×4.6 mm，5? ? ?μm）;以乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸銨溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～15 min，19%A;15～50 min，19%A→35%A;50～55 min，35%A→42%A;55～55.1 min，42%A→19%A;55.1～60 min，19%A）;柱溫為30 ℃;流速為1.2 mL/min;檢測波長為250 nm;進樣量為20 μL。取按“2.3”方法衍生化處理的懷牛膝多糖水解液（樣品編號S6）、陰性對照溶液和混合對照品溶液，分別在此色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在此色譜條件下，各成分峰均能達到良好分離（分離度均大于1.5），理論板數(shù)以甘露糖計大于6 000，且陰性對照溶液對樣品峰的測定不產(chǎn)生干擾。各溶液的衍生化-HPLC圖譜見圖1。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 精密度試驗 取100 mg懷牛膝多糖（樣品編號S6），按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，連續(xù)測定6次，記錄峰面積。以鼠李糖（峰4，該峰分離度良好且穩(wěn)定、峰位相對居中）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法精度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取100 mg懷牛膝多糖（樣品編號S6），共6份，分別按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以鼠李糖（峰4）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取100 mg懷牛膝多糖（樣品編號S6），分別按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以鼠李糖（峰4）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 指紋圖譜的建立及樣品相似度評價 分別稱取10批懷牛膝多糖適量（樣品編號S1～S10），按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。利用《中藥指紋圖譜相似度系統(tǒng)評價軟件》（2012A版）對S1～S10多糖樣品的HPLC指紋圖譜進行分析，選擇編號為S1的多糖樣品的圖譜作為參照圖譜（各峰穩(wěn)定且分離度較好），將時間寬度設(shè)置為0.1 min、間距設(shè)置為50，通過多點校準法生成10批多糖樣品的疊加指紋圖譜，并使用中值法生成對照指紋圖譜（R）。以對照指紋圖譜R為參照，對10批樣品的相似度進行整體評價。結(jié)果，10批樣品的相似度為0.955～0.994;共得到了9個共有峰，以峰4為參照峰計算得各共有峰相對保留時間的RSD為0～2.09%（n=10）、相對峰面積的RSD為0～59.48%（n=10）。該結(jié)果提示，10批懷牛膝多糖樣品的共有成分相似，但含量存在差異。10批懷牛膝多糖的衍生化-HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜見圖2，相似度評價結(jié)果見表2，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積測定結(jié)果分別見表3、表4。

2.5.5 色譜峰的指認 通過將對指紋圖譜R（見圖3）與混合對照溶液衍生化-HPLC圖譜（見圖1A）的色譜峰進行比對，指認了其中5個共有色譜峰，分別為無水葡萄糖（峰1）、甘露糖（峰2）、鼠李糖（峰4）、半乳糖醛酸（峰5）和阿拉伯糖（峰7）。

2.6 聚類分析

將10批懷牛膝多糖衍生化-HPLC圖譜中9個共有峰的峰面積分別導(dǎo)入SPSS 25.0軟件中，采用組間連接方法，以平方歐氏距離作為測量間隔進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離為5時，10批懷牛膝多糖被聚為3類：編號為S1的樣品單獨為一類，相似度為0.955;編號為S2、S5、S8和S9的樣品聚為一類，相似度在0.968～0.985之間;編號為S3、S4、S6、S7和S10的樣品聚為一類，相似度在0.987～0.994之間。10批懷牛膝多糖樣品的聚類分析樹狀圖見圖4。

2.7 單糖成分的含量測定

2.7.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項下各單糖對照品溶液各0.3 mL，分別按“2.3”項下方法進行衍生化處理后，分別取0.2 mL各單糖衍生液于同一10 mL離心管中，充分混勻，即得衍生化處理后的混合對照品溶液。分別吸取該混合對照品溶液0.5、0.45、0.35、0.25、0.15、0.05、0.008 mL于不同的1 mL量瓶中，加甲醇定容，即得系列不同質(zhì)量濃度的溶液，分別按“2.4”項下色譜條件下進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的峰面積（y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果，5種單糖在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好（r均大于0.999 0），結(jié)果見表5。

2.7.2 精密度試驗 取“2.2.1” 項下的單糖對照品溶液各0.3 mL，按“2.3”項下方法衍生化處理后，分別取各單糖衍生液0.2 mL于同一10 mL離心管中，充分混勻，制得混合對照品溶液，然后按 “2.4”色譜條件進樣測定，連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，無水葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.59%、2.78%、2.35%、2.44%、1.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 取100 mg懷牛膝多糖（樣品編號S6），分別按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，無水葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖峰面積的RSD分別為2.35%、2.91%、1.37%、2.79%、1.39%（n=6），表明該溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 重復(fù)性試驗 取100 mg懷牛膝多糖（樣品編號S6），共6份，分別按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并根據(jù)標準曲線計算各待測成分的含量。結(jié)果，無水葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖含量的RSD分別為2.17%、2.75%、1.94%、2.13%、2.86%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗 取100 mg已知含量的懷牛膝多糖（樣品編號S6），共6份，置于不同10 mL離心管中，分別精密加入與已知含量相近的相應(yīng)對照品溶液，按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算出各待測成分的含量，并計算其加樣回收率。結(jié)果，5種單糖的平均加樣回收率為96.52%～99.15%，RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法準確度較好，詳見表6。

2.7.6 樣品含量測定 分別取10批懷牛膝多糖，各約100 mg，精密稱定，分別按“2.2.2”“2.3”項下方法水解并衍生化處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并根據(jù)標準曲線計算5種單糖的含量。每批樣品平行測定3份，取平均值。結(jié)果，10批懷牛膝多糖樣品中無水葡萄糖的含量為6.17～17.55 mg/g、甘露糖的含量為3.31～7.66 mg/g、鼠李糖的含量為38.80～73.97 mg/g、半乳糖醛酸的含量為2.49～8.95 mg/g、阿拉伯糖的含量為11.30～28.58 mg/g，表明不同批次懷牛膝多糖的單糖含量存在一定差異，詳見表7。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

在單糖成分的分析過程中，筆者先考察了在230、240、250、260 nm這4個檢測波長下的檢測效果，發(fā)現(xiàn)在250 nm波長下所得色譜圖的峰形尖銳，檢測效果較在其他3個波長下更好，因此本研究選擇250 nm為檢測波長。此外，筆者分別考察了10、20 μL進樣量對峰形的影響，發(fā)現(xiàn)進樣量為20 μL時的色譜圖峰形更好，故本研究以20 μL為進樣量。筆者進一步考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1 mol/L磷酸鹽溶液、乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液等流動相體系對檢測效果的影響，發(fā)現(xiàn)水相為磷酸緩沖鹽溶液時所需濃度較大，容易發(fā)生色譜柱堵塞，不利于儀器的使用及保護，因此采用乙酸銨溶液作為流動相的水相，并進一步確定0.02 mol/L為水相乙酸銨溶液的濃度。

3.2 混合對照品溶液制備方法的選擇

本研究前期考察了2種方法制備的混合對照品溶液的衍生化效果：第一種是先將各單糖對照品溶液混合，制成混合對照品溶液后，再進行PMP衍生化處理;第二種是先將各單糖對照品溶液分別進行PMP衍生化處理制成單糖對照品衍生液后再進行混合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用第一種方法制備的混合對照品衍生液的HPLC色譜圖峰形不對稱，且部分峰無法分離，筆者推測這可能是混合后的單糖溶液在加熱衍生過程中各單糖間又發(fā)生了反應(yīng)。而本研究最終采用的第二種方法是先制備各單糖衍生液后再混合，可避免受熱后各單糖間發(fā)生反應(yīng)，故進樣后所得色譜圖中各成分的峰形對稱且分離度良好。

3.3 多糖樣品的預(yù)處理及指紋圖譜的分析

指紋圖譜分析目前主要用于中藥的小分子成分，對分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、無紫外吸收的多糖類物質(zhì)不適用[16]。因此，為了提高多糖在HPLC檢測中的靈敏度，多將多糖水解后再以發(fā)光試劑衍生化處理后，再使用HPLC法進行分離和檢測[17-21]。本研究采用PMP為衍生試劑的原理是PMP在堿性條件下可以與單糖定量縮合成PMP-單糖衍生物，該物質(zhì)相對穩(wěn)定，在250 nm波長處具有強光吸收[22-25]。通過分析化合物中多糖的主要單糖組成和相對含量，可以識別不同來源多糖;通過測定多糖中主要單糖成分的絕對含量，可整體上評估不同批次藥材的質(zhì)量[26-27]。

本研究建立了10批不同廠家懷牛膝多糖的衍生化-HPLC指紋特征圖譜，標定了9個共同峰，并指認出了5個特征峰，初步分析出懷牛膝多糖由無水葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖等5種單糖構(gòu)成，由此進一步明確了牛膝多糖中單糖的分布規(guī)律，為其多糖結(jié)構(gòu)分析和質(zhì)量控制提供了有力依據(jù)。但是也可能還存在部分未被識別的單糖，且僅從單糖組成的角度分析多糖仍具有一定的局限性，故后期筆者將從多糖的相對分子量、溶解性及構(gòu)效關(guān)系方面對其進一步研究。

綜上所述，本研究建立了懷牛膝多糖的PMP柱前衍生化-HPLC指紋圖譜及主要單糖成分的含量測定方法，該方法精密度高、準確性好且分離效果較理想，可為懷牛膝飲片的進一步質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2020-10-30 修回日期：2020-12-23）

（編輯：林 靜）