米曲霉固態(tài)發(fā)酵青稞酒糟的研究

楊延玲，楊 剛

(1.南陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 南陽 47300；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

青稞酒是青藏高原的傳統(tǒng)飲品，在釀造青稞酒的過程中會有大量的青稞酒糟產(chǎn)生[1]，青稞酒糟價(jià)格便宜，粗蛋白含量超過20%，蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)良，可溶性蛋白高，能被瘤胃快速降解吸收，碳水化合物瘤胃利用效率高于其他酒糟，瘤胃降解率較高，對于牛羊飼養(yǎng)效果明顯[2]。但青稞酒糟中纖維素含量較高，直接飼喂動物時(shí)，畜禽消化率低。研究表明，青稞酒糟通過微生物發(fā)酵可以顯著提高其粗蛋白含量[3]，將其應(yīng)用于飼料工業(yè)，可有效避免青稞酒糟的浪費(fèi)，降低養(yǎng)殖成本。青貯發(fā)酵的青稞酒糟用于育肥牛中，可以顯著提高粗飼料的品質(zhì)、減少精飼料的使用[4-5]。

米曲霉是食品和飼料工業(yè)常用的微生物菌種之一，用于多種飼料資源的發(fā)酵，可以顯著提高發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價(jià)值[5]，但米曲霉用于青稞酒糟的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)使用米曲霉發(fā)酵青稞酒糟，對其發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化規(guī)律進(jìn)行研究，為青稞酒糟資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

米曲霉(Aspergililusoryzae)，實(shí)驗(yàn)室保存。玉米粉、麩皮、豆粕為市售，其他試劑使用國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米曲霉孢子液制備 先將保藏的米曲霉分離純化，然后在PDA培養(yǎng)基中劃線接種，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)72 h，滅菌生理鹽水沖洗平板，平板計(jì)數(shù)法調(diào)整最終孢子液濃度為1×108/mL 左右。

1.2.2 青稞酒糟固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 以青稞酒糟為主要原料，加入不同含量的玉米粉(0、2.5%、5.0%)、麩皮(0、2.5%、5.0%)、豆粕(0、2.5%、5.0%)、無機(jī)鹽(0、2%、4%)，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，共9個(gè)處理組(表1)，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對照。其中，無機(jī)鹽的配比為：尿素25%、磷酸二氫鉀12.5%、硫酸鎂12.5%、硫酸錳10%、硫酸鋅10%、氯化鈷5% 。

表1 青稞酒糟培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將青稞酒糟和其他培養(yǎng)基混合均勻后，用Ca(OH)2調(diào)整pH值為7.0，放入高壓滅菌鍋，121 ℃高壓20 min后，接種4%的米曲霉孢子液，保持固液比為1∶1.5，30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d，檢測發(fā)酵后青稞酒糟中羧甲基纖維素酶活力和各種纖維素降解率。

1.2.3 米曲霉固體發(fā)酵青稞酒糟過程中酶活和營養(yǎng)物質(zhì)變化規(guī)律 根據(jù)上述優(yōu)化的培養(yǎng)基，加入4%的米曲霉孢子液進(jìn)行發(fā)酵，持續(xù)7 d，每隔24 h取樣檢測，測定不同時(shí)間青稞酒糟中羧甲基纖維素酶活力和蛋白酶活力、青稞酒糟可溶性糖含量、纖維素含量的變化，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵第5天的青稞酒糟，測定其中氨基酸含量，并與空白樣品進(jìn)行對比。

1.2.4 青稞酒糟中酶活和營養(yǎng)物質(zhì)的檢測方法 羧甲基纖維素(CMC)酶活力測定采用DNS法[7]。酶活力單位定義為：在本試驗(yàn)條件下酶活力定義為以對催化底物水解反應(yīng)1 h形成1 μmol葡萄糖的酶量為1U。蛋白酶活力測定采用Folin酚法[8]。水解液中還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[9]。粗纖維成分測定采用Van Soest分析方法[10]。氨基酸含量使用氨基酸自動分析儀測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 以纖維素降解為指標(biāo)的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 以纖維素含量為指標(biāo)，青稞酒糟優(yōu)化培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。說明在青稞酒糟中添加5%玉米粉，2.5%麩皮，5%豆粕，4%無機(jī)鹽時(shí)，青稞酒糟中纖維素降解情況最好。R值結(jié)果表明，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽、麩皮、豆粕和玉米粉對纖維素降解影響依次減小，其中最主要的因素是無機(jī)鹽。

表2 以纖維素降解為指標(biāo)的培養(yǎng)基優(yōu)化

表3為纖維素降解培養(yǎng)基優(yōu)化的方差分析表。從表3結(jié)果可知，無機(jī)鹽、豆粕和玉米粉對青稞酒糟的纖維素降解影響極顯著(P<0.01)，麩皮對纖維素降解沒有明顯影響。

表3 纖維素降解為指標(biāo)培養(yǎng)基優(yōu)化的方差分析

2.1.2 以羧甲基纖維素酶活為指標(biāo)的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 以羧甲基纖維素酶活力為指標(biāo)，青稞酒糟培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4可知，在青稞酒糟中添加玉米粉2.5%，麩皮2.5%，豆粕5%，無機(jī)鹽4%時(shí)，羧甲基纖維素酶活力最高。R值大小從小到大排序?yàn)辂熎?，玉米粉，豆粕，無機(jī)鹽，說明培養(yǎng)基中無機(jī)鹽、豆粕、玉米粉和麩皮對羧甲基纖維素酶產(chǎn)生的影響程度依次降低，其中對于羧甲基纖維素酶活最重要的因素是無機(jī)鹽。

表4 以羧甲基纖維素酶酶活為指標(biāo)的培養(yǎng)基優(yōu)化

以羧甲基纖維素酶為指標(biāo)的培養(yǎng)基優(yōu)化的方差分析表見表5。由表5可知，豆粕、玉米粉、無機(jī)鹽和麩皮4個(gè)因素均對羧甲基纖維素酶的影響極為顯著(P<0.01)。

表5 以羧甲基纖維素酶活為指標(biāo)的培養(yǎng)基優(yōu)化的方差分析

2.1.3 纖維素降解最優(yōu)培養(yǎng)基的確定 青稞酒糟中纖維素含量較高，有效利用其中的纖維素，將其轉(zhuǎn)化為微生物蛋白和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，是米曲霉固態(tài)發(fā)酵青稞酒糟的首要目的，因此，試驗(yàn)中將纖維素的降解和纖維素酶活力作為評價(jià)培養(yǎng)基的技術(shù)指標(biāo)。通過正交試驗(yàn)對比，A3B2C3D3是降解纖維素效果最好的組合，A2B2C3D3是羧甲基纖維素酶酶活最高的組合。綜合以上結(jié)果，青稞酒糟生物降解的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B2C3D3，即5%的玉米粉、2.5%的麩皮、5%的豆粕和4%的無機(jī)鹽。

2.2 米曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中青稞酒糟酶活力及營養(yǎng)成分變化

2.2.1 酶活力變化 由表6可知，米曲霉發(fā)酵青稞酒糟過程中，羧甲基纖維素酶活隨著時(shí)間的增加，1～6 d整體呈上升趨勢，而在第7天隨著纖維素濃度降低則大幅降低(P<0.05)。在發(fā)酵期內(nèi)，前3 d蛋白酶酶活上升顯著(P<0.05)，之后基本保持穩(wěn)定。

表6 米曲霉發(fā)酵青稞酒糟過程中羧甲基纖維素酶活力、蛋白酶活力和可溶性糖含量變化

2.2.2 可溶性糖含量及纖維成分變化 由表6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，青稞酒糟中可溶性糖含量基本呈現(xiàn)下降趨勢，前3 d下降趨勢顯著(P<0.05)，之后基本穩(wěn)定。

由表7可知，青稞酒糟中的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素和半纖維素的含量隨著時(shí)間推移逐漸降低，發(fā)酵3 d、5 d和7 d時(shí)差異顯著(P<0.05)，整個(gè)發(fā)酵過程中木質(zhì)素降低不顯著(P>0.05)。

表7 不同發(fā)酵時(shí)間青稞酒糟的纖維成分變化(以干物質(zhì)為基礎(chǔ)) %

2.2.3 米曲霉發(fā)酵過程中氨基酸含量變化 選取第5天的發(fā)酵酒糟進(jìn)行氨基酸含量測定，結(jié)果如表8所示。結(jié)果表明，米曲霉發(fā)酵青稞酒糟后，其中的纖維素被米曲霉利用，轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)和氨基酸，氨基酸總量、蛋氨酸和賴氨酸等必需氨基酸含量得以提升。

表8 發(fā)酵5 d青稞酒糟氨基酸含量 %

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，米曲霉固體發(fā)酵青稞酒糟的最佳培養(yǎng)基成分配比為5%的玉米粉、2.5%的麩皮、5%的豆粕和4%的無機(jī)鹽。通過發(fā)酵，可以降低青稞酒糟中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素和半纖維素的含量，提高粗蛋白和氨基酸含量，增加了青稞酒糟作為飼料的營養(yǎng)價(jià)值。