重組白細(xì)胞介素-35對(duì)支氣管哮喘模型小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的影響*

胡顯惠，李輝，唐晨曦，蘇云娟，經(jīng)廷森

（重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶401420）

支氣管哮喘（bronchial asthma, BA）是一種常見(jiàn)的與免疫功能紊亂相關(guān)的慢性肺部疾病，臨床癥狀主要為反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶、咳嗽和氣促等，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量。支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥疾病[1]。哮喘的發(fā)病是遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞功能失衡在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，但尚不足以解釋哮喘發(fā)病的全部機(jī)制[2]。近年來(lái)Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的被發(fā)現(xiàn)及其在炎癥中的作用進(jìn)一步完善了支氣管哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制[3]。白細(xì)胞介素（Interleukin, IL） -35 （IL-35） 是由Treg 細(xì)胞分泌的抗炎癥細(xì)胞因子，在維持T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中有重要作用[4]。本研究旨在研究重組IL-35（rIL-35）對(duì)支氣管哮喘模型小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠100 只，7 周齡，體重19～22 g，購(gòu)自北京維通利華有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0003]，于24～26℃、相對(duì)濕度50%～60%、通風(fēng)良好的SPF 級(jí)屏障室內(nèi)飼養(yǎng)，期間自由進(jìn)食及飲水。中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO 細(xì)胞）購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)，采用DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%PBS、1%青鏈霉素）在5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑

佛波酯（PMA）、離子霉素（ionomycin）、布雷非德菌素（BFA）、卵白蛋白（OVA）和乙酰甲膽堿均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，抗小鼠CD4-FITC 抗體購(gòu)自艾美捷科技有限公司，抗小鼠CD25-PE 抗體購(gòu)自美國(guó)Pepro Tech 公司，抗小鼠白細(xì)胞介素-17（IL-17）、Foxp3-APC、PE-anti-IgG1 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，小鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自廣州碧云天生物技術(shù)有限公司，Th1、Th2、Th17和Foxp3專用固定液，Th1、Th2、Th17 和Treg細(xì)胞專用破膜劑，購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司。

1.3 rIL-35蛋白表達(dá)與純化的檢測(cè)

根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）小鼠rIL-35 的核苷酸序列，采用雙酶切構(gòu)建PcDNA5-rIL-35-HIS 真核表達(dá)載體，采用Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后加入1 μg/ml 的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，14 d 后可見(jiàn)單克隆群落形成，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。收集未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和過(guò)表達(dá)rIL-35 細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，采用鎳柱親和層析純化rIL-35 蛋白，超濾濃縮，BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)rIL-35 蛋白濃度。取適量蛋白稀釋后SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，檢測(cè)rIL-35蛋白純度。

1.4 復(fù)制支氣管哮喘小鼠模型

100只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、哮喘組、rIL-35低劑量組、rIL-35中劑量組和rIL-35高劑量組，每組20 只。分別在第1 天和第7 天向哮喘組和rIL-35 各劑量組小鼠腹腔注射OVA 致敏液（含100 μg OVA 和2.25 mg 氫氧化鋁）0.2 ml/只，哮喘組和rIL-35 各劑量組小鼠第14 天開始霧化吸入5%OVA，30 min/次，1 次/d，連續(xù)霧化7 d 以誘發(fā)哮喘。對(duì)照組小鼠則以生理鹽水代替OVA 致敏液。rIL-35各劑量組小鼠在激發(fā)后的第7 天開始腹腔注射不同劑量的rIL-35（低劑量組3 μg/只、中劑量組10 μg/只和高劑量30 μg/只）[5]，1 次/d，連續(xù)5 d。對(duì)照組和哮喘組小鼠則以等量生理鹽水替代rIL-35 進(jìn)行注射。

1.5 氣道反應(yīng)性檢測(cè)

每組隨機(jī)選擇小鼠4只，于末次霧化24 h后，麻醉，剝離暴露氣管，行氣管插管。靜脈留置針插入頸外靜脈后放入測(cè)試儀中，檢測(cè)肺阻力（lung resistance,RL）和肺順應(yīng)性（dynamiccompliance,Cdyn）。將小鼠固定于體描箱內(nèi)的操作臺(tái)上，連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸比為15∶10，潮氣量5 ml/kg，呼吸頻率90 次/min。曲線平穩(wěn)后，每組3 只小鼠分別注射0.05 mg/kg、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg的乙酰甲膽堿，另1只小鼠注射等量生理鹽水（0.9%，0.1 ml/kg）。每次注射后連續(xù)采集記錄5 min。

1.6 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的獲取及處理

rIL-35 注射14 d 后，干冰安樂(lè)處死所有小鼠，呈仰臥位固定于自制小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，打開胸腔進(jìn)行氣管插管，結(jié)扎左側(cè)主支氣管，采用3 ml 預(yù)冷PBS行支氣管肺泡灌洗3 次，收集BALF，將BALF 5 000 r/min 離心5 min，取上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用離心涂片機(jī)對(duì)回收的BALF 進(jìn)行細(xì)胞收集，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)和分類炎癥細(xì)胞。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群

rIL-35注射14 d后，采用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）密度梯度離心法提取BALF中單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸PBMC并調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×106個(gè)/ml，加入終濃度為25 ng/L的PMA、1 mg/ml的ionomycin、3 mg/ml的BFA，以1 ml/孔接種于24孔板，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h。重懸PBMC 于流式管，PBS洗滌2次，5 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入5 ml 抗CD4-FITC 抗體（Treg 細(xì)胞檢測(cè)管需同時(shí)加入5 ml 抗CD25-PE 抗體），室溫避光孵育20 min。PBS洗滌2 次，離心棄上清。加入200 μl Th1、Th2、Th17和Foxp3 專用固定液，室溫避光孵育20 min。PBS洗2 次，5 000 r/min 離心5 min。加入200 μl Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞專用破膜劑，室溫避光孵育20 min。PBS 洗滌2 次，每種細(xì)胞的對(duì)照管加入5 ml抗PE-anti-IgG1同型對(duì)照抗體，實(shí)驗(yàn)管分別加入5 ml抗γ-IFN-PE、IL-4-PE、IL-17 和Foxp3-APC 抗體，室溫避光孵育20 min。PBS洗滌3次，加入500 ml PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用Cell Quest軟件分析T淋巴細(xì)胞亞群水平。

1.8 細(xì)胞因子水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠BALF中IgE、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17、IL-22、IL-10和TGF-β 水平，操作嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或析因設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)比較

對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯異常。哮喘組小鼠致敏后活動(dòng)減少，霧化激發(fā)時(shí)出現(xiàn)不同程度的咳嗽、呼吸急促、煩躁不安、抓耳撓腮、腹部抽搐及大小便失禁等癥狀。rIL-35 低劑量組、rIL-35 中劑量組、rIL-35 高劑量組小鼠霧化激發(fā)時(shí)上述癥狀減輕。

2.2 各組小鼠氣道反應(yīng)性比較

各組小鼠激發(fā)時(shí)RL和Cdyn比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，不同組激發(fā)時(shí)RL和Cdyn比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=986.310和31.160，均P=0.000）。不同劑量乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)RL和Cdyn比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 765.867和207.625，均P=0.000）。乙酰甲膽堿與rIL-35 存在交互作用，隨著乙酰甲膽堿劑量增大，rIL-35劑量減小，激發(fā)時(shí)RL越大（F=202.320，P=0.000），Cdyn越?。‵=5.623，P=0.000）。見(jiàn)表1、2。

表1 各組小鼠激發(fā)時(shí)RL變化 （cmH2O/ml·s，±s）

表1 各組小鼠激發(fā)時(shí)RL變化 （cmH2O/ml·s，±s）

組別對(duì)照組乙酰甲膽堿/（mg/kg）生理鹽水/（ml/kg）1.23±0.10 0.10 2.01±0.24 0.05 1.76±0.21 0.20 2.59±0.33哮喘組rIL-35低劑量組rIL-35中劑量組rIL-35高劑量組1.17±0.11 1.24±0.11 1.19±0.09 1.26±0.14 8.51±0.66 7.33±0.80 5.77±0.58 4.14±0.39 4.36±0.35 3.73±0.35 3.08±0.29 2.57±0.24 11.90±1.05 9.42±1.03 7.64±0.77 5.08±0.49

表2 各組小鼠激發(fā)時(shí)Cdyn變化 （ml/cmH2O，±s）

表2 各組小鼠激發(fā)時(shí)Cdyn變化 （ml/cmH2O，±s）

組別對(duì)照組乙酰甲膽堿/（mg/kg）生理鹽水/（ml/kg）0.052±0.010 0.10 0.038±0.008 0.05 0.046±0.009 0.20 0.032±0.011哮喘組rIL-35低劑量組rIL-35中劑量組rIL-35高劑量組0.057±0.011 0.048±0.009 0.049±0.013 0.055±0.014 0.020±0.006 0.026±0.005 0.030±0.006 0.031±0.009 0.026±0.008 0.031±0.005 0.032±0.007 0.038±0.010 0.011±0.005 0.016±0.006 0.022±0.008 0.028±0.009

2.3 各組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類

各組小鼠BALF 中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)量的比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠BALF 中的細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量均增加（P＜0.05）；與哮喘組小鼠比較，rIL-35 低劑量組、rIL-35 中劑量組、rIL-35 高劑量組小鼠BALF 中的細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量均減少（P＜0.05），均呈隨rIL-35 蛋白劑量增加而減少的趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

2.4 各組小鼠BALF中T淋巴細(xì)胞亞群的變化

各組小鼠BALF 中Th2、Th17、Th1、Treg、Th1/Th2、Th17/Treg 的比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠BALF 中Th2、Th17、Th17/Treg 水平升高，Th1、Treg、Th1/Th2 水平降低（P＜0.05）；與哮喘組比較，rIL-35 低劑量組、rIL-35 中劑量組、rIL-35 高劑量組小鼠BALF中Th2、Th17、Th17/Treg 水平降低（P＜0.05），均呈隨rIL-35 劑量增加而降低的趨勢(shì)，Th1、Treg、Th1/Th2 水平升高（P＜0.05），均呈隨rIL-35 劑量增加而升高的趨勢(shì)。見(jiàn)表4。

2.5 各組小鼠BALF 中IgE、IL-2、IFN-γ、IL-4 和IL-5水平比較

各組小鼠BALF 中IgE、IL-2、IFN-γ、IL-4 和IL-5 水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠BALF 中IL-2、IFN-γ 水平降低，而IgE、IL-4 和IL-5 水平升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，rIL-35低劑量組、rIL-35中劑量組、rIL-35高劑量組小鼠BALF 中IL-2、IFN-γ 水平升高（P＜0.05），且呈隨rIL-35 劑量增加而升高的趨勢(shì)，IgE、IL-4 和IL-5 水平降低（P＜0.05），均呈隨rIL-35 蛋白劑量增加而降低趨勢(shì)。見(jiàn)表5。

表3 各組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 （±s）

表3 各組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別細(xì)胞總數(shù)/（×105個(gè)/ml）嗜酸性粒細(xì)胞/%淋巴細(xì)胞/%中性粒細(xì)胞/%對(duì)照組哮喘組rIL-35低劑量組rIL-35中劑量組rIL-35高劑量組F 值P 值8.63±0.67 29.13±2.14①23.44±2.02②18.45±1.50②15.96±1.75②6.277 0.021 3.22±0.28 19.93±1.75①15 .02±1.13②10.24±0.84②8.58±0.79②12.032 0.001 8.14±0.69 26.44±2.25①23.23±1.92②16.23±1.44②12.17±1.09②6.795 0.019 6.36±0.49 27.91±3.00①22.36±2.08②15.47±1.38②11.38±1.26②8.042 0.009

表4 各組小鼠BALF中T淋巴細(xì)胞亞群比較 （±s）

表4 各組小鼠BALF中T淋巴細(xì)胞亞群比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別Th17/Treg Th1/%Th2/%Th17/%Treg/%Th1/Th2對(duì)照組哮喘組rIL-35低劑量組rIL-35中劑量組rIL-35高劑量組F 值P 值0.32±0.06 1.52±0.12①1.10±0.10②0.83±0.12②0.66±0.09②7.833 0.017 20.60±2.01 11.57±1.33①14.05±1.22②17.01±1.39②17.53±1.41②2.268 0.040 2.25±0.21 5.71±0.48①4.95±0.42②4.13±0.39②3.50±0.33②3.526 0.034 2.51±0.20 5.97±0.46①4.91±0.36②4.11±0.34②3.37±0.30②4.804 0.029 7.83±0.62 3.92±0.33①4.42±0.37②5.04±0.49②5.56±0.50②2.850 0.037 9.18±1.10 2.19±0.30①3.65±0.33②4.59±0.42②5.89±0.57②5.776 0.022

表5 各組小鼠BALF中IgE、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5水平比較 （pg/ml，±s）

表5 各組小鼠BALF中IgE、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5水平比較 （pg/ml，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別IL-5 IgE IL-2 IFN-γ IL-4對(duì)照組哮喘組rIL-35低劑量組rIL-35中劑量組rIL-35高劑量組F 值P 值30.13±2.89 203.41±22.30①130.15±11.44②99.41±7.75②75.58±7.92②15.728 0.000 5.05±0.43 19.14±1.51①14.36±1.21②12.87±1.13②9.04±0.78②6.275 0.020 95.50±10.03 28.80±3.14①43.45±4.09②61.94±7.29②73.14±7.03②7.027 0.017 150.17±16.25 40.93±3.77①84.16±9.02②107.28±9.64②119.77±11.73②8.219 0.010 57.47±6.11 222.23±24.31①147.51±12.05②100.79±9.58②91.29±8.88②9.002 0.005

2.6 各組小鼠BALF 中IL-17、IL-22、IL-10 和TGF-β水平比較

各組小鼠BALF 中IL-17、IL-22、IL-10 和TGF-β 水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠BALF 中IL-17、IL-22 水平升高，而IL-10 和TGF-β 水平降低（P＜0.05）；與哮喘組比較，rIL-35低劑量組、rIL-35中劑量組、rIL-35高劑量組小鼠BALF中IL-17、IL-22水平降低（P＜0.05），且呈隨rIL-35 劑量增加而降低趨勢(shì)，IL-10 和TGF-β水平升高（P＜0.05），且呈隨rIL-35 劑量增加而升高趨勢(shì)。見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠BALF中IL-17、IL-22、IL-10和TGF-β水平比較 （pg/ml，±s）

表6 各組小鼠BALF中IL-17、IL-22、IL-10和TGF-β水平比較 （pg/ml，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別TGF-β IL-17 IL-22 IL-10對(duì)照組哮喘組rIL-35低劑量組rIL-35中劑量組rIL-35高劑量組F 值P 值62.91±5.77 27.04±2.55①38.82±3.93②49.48±5.03②53.77±5.21②4.164 0.029 10.59±1.12 52.88±5.65①39.76±3.54②30.03±3.01②22.21±2.14②10.327 0.002 15.82±1.47 60.17±6.10①48.61±4.29②39.95±3.56②30.06±3.37②7.165 0.016 8.93±0.72 3.31±0.29①6.19±0.59②6.76±0.58②7.82±0.64②5.003 0.024

3 討論

T 淋巴細(xì)胞在支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。研究顯示，肥大細(xì)胞是哮喘發(fā)生的始動(dòng)效應(yīng)細(xì)胞，而由T 淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子導(dǎo)致的炎癥直接啟動(dòng)哮喘的發(fā)病[5]。T 輔助淋巴細(xì)胞（CD4+）包含Th1、Th2、Th17 和Treg 4 類不同的細(xì)胞亞群。傳統(tǒng)研究認(rèn)為由CD4+分化的Th1/Th2 細(xì)胞比例失衡是導(dǎo)致支氣管哮喘氣道炎癥的基礎(chǔ)[6]。Th2 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)已被證實(shí)是變應(yīng)性哮喘形成與進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制，哮喘發(fā)作時(shí)Th2 細(xì)胞免疫功能亢奮，Th1 細(xì)胞免疫反應(yīng)下降[7]。近年來(lái)Th17/Treg 細(xì)胞平衡在變態(tài)反應(yīng)性疾病中的免疫調(diào)節(jié)功能逐漸引起注意。研究顯示，Th17 細(xì)胞可介導(dǎo)支氣管哮喘患者體內(nèi)炎癥的發(fā)展，并破壞機(jī)體免疫平衡，Treg 細(xì)胞的功能受到抑制，Th17/Treg 細(xì)胞比例升高[8]。

rIL-35 是IL-12 家族的新成員，是由EB 病毒誘導(dǎo)基因3 和IL-12 的p35 亞基組成的異源二聚體[9]。與其家族中的其他成員不同，rIL-35 主要發(fā)揮免疫抑制的功能，在炎癥疾病和腫瘤的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10]。已有研究表明，LI-35 可抑制Th17 細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)Treg 細(xì)胞的免疫抑制功能，從而抑制機(jī)體的過(guò)度免疫反應(yīng)[11]。此外，VIGNALI 等[12]研究顯示，IL-35 還可通過(guò)抑制IL-4 和GATA3 的表達(dá)阻礙Th2 細(xì)胞的分化，并可調(diào)節(jié)Th1 和Th2 細(xì)胞向Treg 細(xì)胞轉(zhuǎn)化。綜合上述研究結(jié)論，推測(cè)LI-35可能在Th1/Th2 和Th17/Treg 細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有望為支氣管哮喘等變態(tài)免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)和治療提供新的思路。

本研究通過(guò)向支氣管哮喘模型小鼠注射rIL-35蛋白，探究rIL-35 對(duì)哮喘模型小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群及其分泌的細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示，哮喘模型小鼠BALF 中的細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的數(shù)量增加，表明小鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，小鼠模型復(fù)制成功。經(jīng)注射rIL-35 后，小鼠BALF 中的細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量降低，并呈rIL-35 劑量依賴性降低趨勢(shì)，提示給予rIL-35 可抑制哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)。

Th1 和Th2 由共同的前體細(xì)胞Th0 分化而來(lái)，Th1 細(xì)胞通過(guò)分泌IL-2、IFN-γ、IL-12 等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞的免疫反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)[13]。Th2 細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10 等細(xì)胞因子可激活抗原特異的B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫[14]。Th17 作為一種效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞，主要通過(guò)分泌IL-17、IL-21、IL-22 等多種炎癥因子參與自身免疫性疾病、感染性疾病等多種疾病的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，在機(jī)體免疫中主要起促炎作用[15]。Treg 細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-10 和TGF-β 介導(dǎo)免疫抑制，可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活化引起的免疫反應(yīng)，具有維持自身免疫耐受的功能[16]。正常情況下，Th1/Th2 和Th17/Treg 細(xì)胞相互拮抗，共同維持機(jī)體免疫的平衡狀態(tài)[17-18]。

為進(jìn)一步分析rIL-35 抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥的機(jī)制，本研究檢測(cè)各組小鼠BALF 中Th1、Th2、Th17 和Treg 細(xì)胞亞群的水平，結(jié)果顯示，哮喘組小鼠Th2 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、Th17/Treg 細(xì)胞比例較對(duì)照組小鼠增加，而Th1 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、Th1/Th2 細(xì)胞比例降低，與哮喘組比較，rIL-35 各劑量組小鼠Th2 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、Th17/Treg 細(xì)胞比例降低，且呈rIL-35 劑量增加而降低的趨勢(shì)，Th1 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、Th1/Th2 細(xì)胞比例增加，且呈rIL-35 劑量增加而呈升高的趨勢(shì)，表明rIL-35 可改善哮喘模型小鼠體內(nèi)Th1/Th2 和Th17/Treg 細(xì)胞失衡。小鼠BALF中細(xì)胞因子的ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-10 和TGF-β 的水平降低，IgE、IL-4、IL-5、IL-17 和IL-22 水平升高，與哮喘組比較，rIL-35 各劑量組小鼠BALF 中IL-2、IFN-γ、IL-10 和TGF-β 的水平升高，且呈rIL-35 劑量增加而升高趨勢(shì)，IgE、IL-4、IL-5、IL-17 和IL-22 水平降低，且呈rIL-35 劑量增加而降低趨勢(shì)，表明rIL-35 可能通過(guò)促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的釋放、抑制促炎細(xì)胞因子的分泌、調(diào)控Th1/Th2 和Th17/Treg 細(xì)胞的分化改善支氣管哮喘炎癥反應(yīng)的發(fā)展，增強(qiáng)肺部和呼吸道的免疫耐受，但具體信號(hào)通路有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，rIL-35 可有效調(diào)節(jié)支氣管哮喘模型小鼠體內(nèi)Th1/Th2 和Th17/Treg 細(xì)胞的免疫失衡，緩解哮喘氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生，有望為支氣管哮喘的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。