PPAR γ基因多態(tài)性與新生兒肺炎易感性及血清炎癥細胞因子的關(guān)系

田靜，惠曉君，張靖，任亞方，張朋

（南陽市中心醫(yī)院1.新生兒科，2.小兒外科，河南 南陽473000）

感染性肺炎是新生兒的常見疾病之一，也是引起新生兒病死的常見病因之一，其發(fā)生與新生兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，容易感染細菌、病毒、支原體等病原菌有關(guān)，但具體的發(fā)病機制未完全闡明。 過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPAR γ）屬于核受體超家族，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，參與糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控[1-2]。編碼PPAR γ基因存在廣泛的單核苷酸多態(tài) 性（single nucleotide polymorphism, SNP），其 中rs1801282 是研究最多的PPAR γ基因SNP 位點[3-4]。該位點CCA 向GCA 的突變被證實是≥14 歲的肺炎膿毒癥患者發(fā)生多器官功能障礙的保護因素[5]，但這一突變是否與新生兒肺炎的發(fā)生有關(guān)尚未見明確報道。為此，本研究擬檢測肺炎新生兒PPAR γ基因rs1801282 位點的SNP，分析該基因SNP 與新生兒肺炎發(fā)生、血清炎癥細胞因子質(zhì)量濃度的關(guān)系，進而為新生兒肺炎發(fā)病機制的研究及未來疾病的個體化防治提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2016年3月—2019年3月南陽市中心醫(yī)院收治的感染性肺炎新生兒90 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合新生兒細菌性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②胎齡37～42 周；③臨床資料及臨床樣本完整；④取得家長知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有宮內(nèi)缺氧或新生兒窒息史；②有吸入性肺炎、新生兒呼吸窘迫綜合征；③合并先天性畸形或其他先天性疾病；④合并免疫缺陷。根據(jù)病情將感染性肺炎新生兒分為輕癥肺炎組52 例和重癥肺炎組38 例。另取同期在該院分娩的80 例健康新生兒作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。3 組新生兒一般資料的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 3組新生兒一般資料的比較

1.2 方法

1.2.1 重癥肺炎的評價方法感染性肺炎新生兒符合下列任意1 項，即判斷為重癥肺炎：①吸入氧濃度（FiO2）≥60%，監(jiān)測動脈血氧飽和度（SaO2）＜92%；②出現(xiàn)休克；③出現(xiàn)呼吸窘迫或多器官衰竭；④出現(xiàn)反復(fù)呼吸暫?；蚵灰?guī)則的呼吸。

1.2.2 PPAR γ 基因rs1801282 位點SNP的檢測采集3 組新生兒的靜脈血2 ml，EDTA 抗凝后采用血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根公司）分離提取抗凝靜脈血中的基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進行。得到基因組DNA 后，配置PCR 體系：基因組DNA 1 μl、2×Taq PCR 預(yù)混試劑Ⅱ10 μl、10 μmol/L 的正反向引物各0.4 μl、去離子水8.2 μl。按照下列程序進行反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35 次。取PCR產(chǎn)物，配置酶切體系，37℃水浴過夜。次日，取酶切產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判斷PPAR γ基因rs1801282 位點的SNP。

1.2.3 血清炎癥細胞因子的檢測采集3 組新生兒的靜脈血2 ml，室溫靜置30 min 后自然凝血，3 000 r/min 離心20 min，分離上層血清后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（試劑盒購自上海西唐公司）檢測白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的質(zhì)量濃度，操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組新生兒PPAR γ基因rs1801282位點多態(tài)性的比較

PCR 酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖如圖1所示，酶切產(chǎn)物為267 bp 是GG 基因型，酶切產(chǎn)物為267 bp、224 bp、43 bp 是GC 基因型，酶切產(chǎn)物為224 bp、43 bp 是CC 基因型。PPAR γ基因rs1801282 位點CC為野生基因型，GC、GG 為突變基因型。3 組新生兒CC 基因型的比例及等位基因C 的頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；重癥肺炎組和輕癥肺炎組新生兒CC 基因型的比例及等位基因C 的頻率高于對照組，GC+GG 基因型的比例及等位基因G 的頻率低于對照組；重癥肺炎組新生兒CC 基因型的比例及等位基因C 的頻率高于輕癥肺炎組，GC+GG 基因型的比例及等位基因G 的頻率低于輕癥肺炎組。見表2。

2.2 3組新生兒血清炎癥細胞因子的比較

圖1 PCR酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖

表2 3組PPAR γ基因rs1801282位點多態(tài)性的比較例（%）

3 組新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 的質(zhì)量濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，重癥肺炎組和輕癥肺炎組新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質(zhì)量濃度高于對照組（P＜0.05），重癥肺炎組新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質(zhì)量濃度高于輕癥肺炎組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質(zhì)量濃度的比較（±s）

表3 3組血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質(zhì)量濃度的比較（±s）

組別n IL-6/（pg/ml）TNF-α/（ng/ml）ICAM-1/（ng/ml）對照組輕癥肺炎組重癥肺炎組F 值P 值80 52 38 9.93±1.34 20.37±5.57 41.94±8.94 470.862 0.000 41.22±7.96 60.39±11.91 131.28±26.58 462.197 0.000 137.65±28.79 201.41±48.93 376.57±71.47 327.475 0.000

2.3 肺炎組中不同PPAR γ 基因多態(tài)性新生兒血清炎癥細胞因子的比較

肺炎組中PPAR γ基因rs1801282 位點GC+GG 基因型新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質(zhì)量濃度低于CC 基因型新生兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 肺炎組中不同PPAR γ基因多態(tài)性新生兒血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質(zhì)量濃度的比較 （±s）

表4 肺炎組中不同PPAR γ基因多態(tài)性新生兒血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質(zhì)量濃度的比較 （±s）

組別n IL-6/（pg/ml）TNF-α/（ng/ml）ICAM-1/（ng/ml）GC+GG基因型CC基因型t 值P 值9 8 1 26.12±6.68 59.69±11.83 13.088 0.000 87.75±10.39 113.46±29.49 5.497 0.000 266.59±44.48 354.31±89.49 4.967 0.000

3 討論

PPAR γ是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。PPAR γ基因存在廣泛的多態(tài)性，其中rs1801282 是目前研究最廣泛的PPAR-γ基因SNP 位點，該位點位于外顯子2 第12位密碼子，發(fā)生CCA 向GCA 的突變后、編碼的氨基酸從脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，進而造成編碼產(chǎn)物蛋白結(jié)構(gòu)及功能的改變[6-7]。該突變在不同人群中存在差異，其中亞洲人群中PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的發(fā)生率低于白種人[8]。張曉伏[9]報道，漢族人群PPAR γ基因rs1801282 位點GC+GG 突變基因型的比例約15%且發(fā)生純合突變，即GG 基因型的患者僅1 例。本研究所納入的健康新生兒中，PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的發(fā)生率為20%，與國內(nèi)已有的研究報道基本一致。

PPAR γ基因的編碼產(chǎn)物具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[10-11]，當(dāng)rs1801282 位點發(fā)生SNP 后，PPAR γ基因編碼產(chǎn)物的抑炎作用可能受到影響，進而參與多種炎癥疾病的發(fā)生[12-13]。朱小蔚[5]對肺炎膿毒癥患者PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的分析證實，合并重度器官衰竭的肺炎膿毒癥患者無一例發(fā)生GG 純合突變，僅1 例發(fā)生GC 雜合突變，rs1801282 位點GC+GG 基因型的比例低于輕度器官衰竭的肺炎膿毒癥患者，提示PPAR γ基因rs1801282 位點C 向G 的突變可能在肺炎膿毒癥中起到保護作用。本研究肺炎新生兒PPAR γ基因rs1801282 位點CC 基因型的比例高于對照組，GC+GG 基因型的比例低于對照組，重癥肺炎組CC 基因型的比例高于輕癥肺炎組，GC+GG 基因型的比例低于輕癥肺炎組，說明PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 與新生兒肺炎的發(fā)生有關(guān)，C向G 突變的減少會造成新生兒肺炎的發(fā)生。

PPAR γ的抑炎作用與其對多種炎癥細胞因子表達的抑制作用有關(guān)，孫小平[14]的動物實驗證實，PPAR γ的激動劑羅格列酮對膿毒癥小鼠炎癥細胞因子IL-6、TNF-α 的分泌具有抑制作用；BHAT[15]的動物實驗證實，PPAR γ對高脂血癥小鼠體內(nèi)炎癥細胞因子ICAM-1 的分泌具有抑制作用。IL-6、TNF-α、ICAM-1 3 種炎癥細胞因子在炎癥反應(yīng)的激活過程中起到促炎、促黏附等作用，已經(jīng)被證實在新生兒肺炎的發(fā)病過程中大量分泌[16-18]。本研究對肺炎新生兒血清中炎癥細胞因子的分析結(jié)果與已有的研究一致，即肺炎新生兒血清中IL-6、TNF-α、ICAM-1 的質(zhì)量濃度升高且重癥肺炎組血清中IL-6、TNF-α、ICAM-1 的質(zhì)量濃度高于輕癥肺炎組。進一步分析PPAR γ多態(tài)性對血清炎癥細胞因子分泌的影響可知，肺炎組中PPAR γ基因rs1801282 位點GC+GG 基因型新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質(zhì)量濃度低于CC 基因型新生兒，說明PPAR γ基因rs1801282位點C 向G 的突變能夠起到抑炎作用，減少炎癥細胞因子的釋放。

綜上所述，本研究對PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的分析說明，PPAR γ基因多態(tài)性與新生兒肺炎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，C 向G 的突變是在發(fā)病過程中起保護作用，能夠減少多種炎癥細胞因子的釋放；PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的檢測可能作為篩查新生兒肺炎高危人群的潛在靶點，為疾病的個體化防治提供依據(jù)。