尿液及血清骨膜蛋白的檢測對早期診斷兒童紫癜性腎炎的價值

王麗，周小勤，涂丹娜，黃方，陳霞

作者單位：1湖北省婦幼保健院兒內(nèi)科，湖北 武漢430070；

2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院、襄陽市中心醫(yī)院兒科，湖北 襄陽441021

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是發(fā)生在兒童中一種免疫球蛋白A（IgA）介導(dǎo)的系統(tǒng)性小血管炎，IgA 抗體在血管壁上的沉積會導(dǎo)致皮膚、關(guān)節(jié)、腸和腎臟的癥狀。紫癜性腎炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是HSP 最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，通常定義為HSP伴有血尿和/或蛋白尿的腎臟受累，并且通常決定HSP病人的預(yù)后，相關(guān)研究結(jié)果顯示HSPN 在兒童繼發(fā)性腎小球疾病中占第一位。骨膜蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是由成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞分泌的，多在牙周韌帶和骨膜中出現(xiàn)，與皮膚修復(fù)、牙齒與骨骼生長有關(guān)。近年研究顯示，骨膜蛋白在一些腎病中有表達(dá)，其在HSPN 中的作用研究較少。本研究通過檢測HSPN 病兒尿液與血清中骨膜蛋白的表達(dá)水平，探討骨膜蛋白的檢測對早期診斷兒童HSPN的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012 年6 月至2018 年6 月在湖北省婦幼保健院就診的HSPN 病兒35 例為HSPN組，其中男性19 例，女性16 例，年齡（8.62±1.68）歲，年齡范圍為6～11 歲。納入的HSPN 病兒均符合兒童HSPN 診治循證指南（2016 年由中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟學(xué)組制定）。選取同期在湖北省婦幼保健院門診健康體檢的35例兒童為健康對照組，其中男性19 例，女性16 例，年齡（8.38±1.72）歲，年齡范圍為6～11 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①近1 個月未服用存在腎毒性藥物；②既往無泌尿系統(tǒng)及腎臟疾病，尿檢篩查正常，家族無腎臟遺傳性疾病。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.629，P=0.072），具有可比性。病兒近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 樣本采集

HSPN 組病兒在就診第二天早晨采集尿液和血液樣本，健康對照組兒童于體檢時留取尿液和血液樣本。具體方法：在清洗外陰后采集中斷尿5 mL 作為尿液樣本，采集外周靜脈血3 mL 作為血液樣本，并在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min。分別吸取上層尿液及上層血清至無菌干燥的EP 管中，將所得樣本分別編號后置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?p>1.3 骨膜蛋白的測定

1.3.1

實驗材料與器材 人骨膜蛋白試劑盒（購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司），酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司），振蕩器（匯誠生物科技有限公司）。

1.3.2

實驗方法 采用ELISA法檢測血清和尿的樣品中骨膜蛋白的相對表達(dá)水平，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。（1）實驗前準(zhǔn)備：試劑盒、血清和尿的樣品均置于室溫中復(fù)溫，以備后續(xù)實驗使用。（2）實驗過程：①將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品分別加入反應(yīng)孔中，蓋上膜蓋后輕輕振蕩，37 ℃孵育30 min。②棄去孔內(nèi)液體，加入配制好的洗滌液，洗滌5次并拍干。③除空白孔之外的反應(yīng)孔中加入酶標(biāo)試劑50 μL。孵育、洗滌同前。④每孔加入A、B 顯色劑各50 μL，輕輕混勻，37 ℃孵育10 min，避免光照。迅速加入50 μL 終止液。⑤在450 nm 波長處測定各孔的OD 值。（3）計算方法：根據(jù)樣品的OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋的倍數(shù)，計算出樣品中人骨膜蛋白的實際濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用x ± s 表示，比較采用t 檢驗，采用Medcalc 軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線）并進(jìn)行分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組尿液及血清骨膜蛋白表達(dá)水平比較

兩組尿液及血清中骨膜蛋白表達(dá)水平均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見表1。

表1 健康對照組與紫癜性腎炎（HSPN）組尿液及血清中骨膜蛋白表達(dá)水平比較/（pg/mL，±s）

2.2 尿液及血清骨膜蛋白ROC 曲線

為了評價尿液及血清骨膜蛋白對兒童HSPN 早期診斷的價值，本研究通過繪制ROC 曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示曲線下面積（AUC）分別為0.838 與0.778，病兒尿液中骨膜蛋白表達(dá)水平的靈敏度和特異度相對較好，尿液及血清骨膜蛋白對兒童HSPN 早期診斷的價值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=6.528，P ＜0.01）。見圖1和表2。

圖1 尿液及血清骨膜蛋白ROC曲線

表2 尿液及血清骨膜蛋白對兒童紫癜性腎炎（HSPN）早期診斷的ROC分析

3 討論

HSP是一種小血管、白細(xì)胞碎裂性血管炎，可在不同器官中引起多種癥狀。HSP是兒童時期最常見的系統(tǒng)性血管炎之一，男孩的發(fā)病率略高于女孩，有研究顯示17 歲以下兒童HSP 患病率為6～24/10萬，而HSPN 通常為HSP 伴有血尿和/或蛋白尿的腎臟受累。大約20%的HSPN 病人發(fā)展為腎病或腎病綜合征，基于大量臨床和實驗研究的結(jié)果顯示，在HSPN 腎小球中腎外來源的含IgA 免疫復(fù)合物的腎小球沉積可導(dǎo)致腎臟炎癥改變，因此，HSPN 可被視為免疫復(fù)合物腎炎。骨膜蛋白作為由成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，多在牙周韌帶和骨膜中出現(xiàn)，并參與皮膚修復(fù)、牙齒與骨骼生長。近年來，有關(guān)骨膜蛋白在腎臟中的作用得到了研究人員的重視，Hwang等的研究結(jié)果顯示，在IgA 腎病腎纖維化病人尿中骨膜蛋白可能是早期生物標(biāo)志物。有研究顯示在狼瘡性腎炎病人中，骨膜蛋白主要表達(dá)于腎小球周圍發(fā)生纖維化的部位與硬化的腎小球中。在糖尿病腎病病人的腎小管和腎小球中骨膜蛋白均有表達(dá)，結(jié)果顯示腎功能與骨膜蛋白表達(dá)量相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：HSPN組尿液及血清中骨膜蛋白的表達(dá)量均高于健康對照組，推測在HSPN 的發(fā)生發(fā)展過程中骨膜蛋白可能參與其中，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥免疫反應(yīng)時，刺激纖維化的腎組織及腎血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生骨膜蛋白并釋放入血；而過敏性紫癜病兒發(fā)生腎損傷時，受損的腎組織被誘導(dǎo)表達(dá)骨膜蛋白，骨膜蛋白通過腎小管上皮細(xì)胞分泌或表達(dá)骨膜蛋白的細(xì)胞退化脫落至尿液中導(dǎo)致尿骨膜蛋白增加。本研究通過繪制ROC曲線進(jìn)行分析，曲線下面積（AUC）分別為0.838與0.778，尿液及血清骨膜蛋白對兒童HSPN 早期診斷的價值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，病兒尿液中骨膜蛋白表達(dá)水平的靈敏度和特異度相對較好，提示我們在HSPN的相關(guān)研究中尿骨膜蛋白可作為敏感指標(biāo)。