微生物檢測技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

◎ 張彩鳳，閆 珍，范陽璇

（陜西科儀陽光檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，陜西 西安 710000）

當(dāng)前我國食品安全整體呈現(xiàn)出穩(wěn)中向好的形勢，但在市場監(jiān)管部門抽檢過程中仍發(fā)現(xiàn)存在食品安全問題，其中因微生物污染引發(fā)的樣品不合格率較高，以餐飲單位為高發(fā)區(qū)，說明食品安全監(jiān)督與檢驗(yàn)工作仍需持續(xù)深入開展。通過結(jié)合食品安全管理要求進(jìn)行常用檢測技術(shù)的梳理，對于食品檢驗(yàn)工作水平與效率的提升具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 技術(shù)特征

1.1 檢驗(yàn)流程

根據(jù)相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的工作程序，當(dāng)委托方下達(dá)任務(wù)、完成合同評審、確認(rèn)檢驗(yàn)資質(zhì)后，即正式進(jìn)入以下食品檢驗(yàn)流程。①抽樣工作，根據(jù)《國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2021年版）》要求，選派經(jīng)由專業(yè)培訓(xùn)的抽樣人員開展抽樣工作，核對待檢樣品的類別、數(shù)量等基本信息，確認(rèn)符合檢驗(yàn)規(guī)定。②樣品核對，由具體科室工作人員對接收的樣品進(jìn)行外觀信息、狀態(tài)標(biāo)識、抽樣類型、檢驗(yàn)用量等信息的逐一核對，并完成照片采集。③樣品制備，根據(jù)檢測要求完成待測標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備，落實(shí)樣品保護(hù)與存放。④樣品檢驗(yàn)，由工作人員依照檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品、儀器及各類試劑的核對，在檢驗(yàn)過程中嚴(yán)格依據(jù)要求做空白試驗(yàn)等，做好樣品質(zhì)量控制。⑤復(fù)測實(shí)驗(yàn)，當(dāng)檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)存在樣品不合格問題時，需及時依據(jù)項(xiàng)目特征安排開展復(fù)測，將復(fù)測結(jié)果與初試結(jié)果進(jìn)行比較分析，明確引發(fā)數(shù)據(jù)差異的原因，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確合理。⑥生成原始記錄，完成檢驗(yàn)報告的校對、審核與簽發(fā)，最終將檢驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入平臺中[1]。

1.2 技術(shù)特點(diǎn)

食品檢驗(yàn)工作涉及的微生物來源較廣、病原微生物類型多樣，諸如人畜疾病感染、食品存放方法不當(dāng)導(dǎo)致變質(zhì)、食品運(yùn)輸過程中出現(xiàn)破損等因素均有可能造成病原微生物的傳播[2]。在實(shí)際檢驗(yàn)內(nèi)容上，諸如致病菌類型、分布特征、菌落總數(shù)等指標(biāo)均需詳細(xì)列出，將上述指標(biāo)實(shí)測結(jié)果與預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)限值進(jìn)行比較，用于判斷食品的致病性，并且結(jié)合致病菌類型、菌落總數(shù)等指標(biāo)能夠輔助判斷食品生產(chǎn)日期與有害物質(zhì)、變質(zhì)物質(zhì)的摻入時間等，倘若任一指標(biāo)超出限值均可判定該食品不符合衛(wèi)生質(zhì)量要求，相應(yīng)地對于技術(shù)應(yīng)用環(huán)節(jié)的準(zhǔn)確性與檢測時效性也提出了較高的要求[3]。

2 微生物檢測技術(shù)的應(yīng)用

2.1 基本檢測技術(shù)

2.1.1 生理生化技術(shù)

（1）ATP生物發(fā)光技術(shù)。ATP即腺嘌呤核苷三磷酸的簡稱，該化合物廣泛分布于活體生物中，通過運(yùn)用該技術(shù)獲取待測樣品的ATP濃度數(shù)值，初步完成樣品中活菌數(shù)量的估算；隨后采用光度計(jì)獲取待測樣品的熒光強(qiáng)度，即可生成細(xì)菌數(shù)量的準(zhǔn)確值。該技術(shù)適用于食品微生物的現(xiàn)場檢測，具有便于操作、檢測速度快的特點(diǎn)，應(yīng)用防范較廣[4]。以ATP生物發(fā)光法在酸奶微生物檢測中的應(yīng)用為例，檢測步驟為先繪制出ATP生物發(fā)光值、樣品微生物含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)由取樣、提取ATP、添加酶反應(yīng)試劑、樣品微生物ATP發(fā)光值測定4項(xiàng)流程，最終以標(biāo)準(zhǔn)曲線的形式反映樣品中微生物實(shí)際數(shù)值的測定結(jié)果，整體檢測靈敏度較高，可在食品分析檢測領(lǐng)域較好應(yīng)用[5]。

（2）微量生化法。該方法可細(xì)分為兩種技術(shù)，一種是熱微量技術(shù)，根據(jù)食物中菌落在不同生長階段的熱量變化情況，實(shí)現(xiàn)對菌落生長周期與菌種的精確識別；另一種是放射測量技術(shù)，根據(jù)菌群不同生長周期釋放的放射性CO2氣體含量，完成菌種數(shù)量的計(jì)算，并推算出菌群類型，可在較短時間內(nèi)快速準(zhǔn)確完成微生物測定，具有較為理想的使用效果。

2.1.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

該技術(shù)主要基于免疫學(xué)理論進(jìn)行食品中病原菌、微生物的檢測，其中非標(biāo)記免疫分析作為典型技術(shù)之一，依托凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與、中和試驗(yàn)等多個環(huán)節(jié)完成對待測樣品中細(xì)菌、病毒等微生物的檢測。該技術(shù)對于檢測儀器、設(shè)備的精密度無過高要求，能夠保證檢測結(jié)果的精確性，但由于涉及的檢測流程較為煩瑣，導(dǎo)致檢測效率不高，目前僅適用于經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)或儀器配置落后區(qū)域的食品檢測。

2.2 快速檢測技術(shù)

2.2.1 生物傳感器檢測技術(shù)

該技術(shù)集成物理、化學(xué)、生物學(xué)等多學(xué)科基礎(chǔ)理論，根據(jù)活性生物普遍存在的物理變化特征及其發(fā)生化學(xué)變化時形成的感應(yīng)條件，借助相關(guān)轉(zhuǎn)換器實(shí)現(xiàn)對反應(yīng)變化情況的捕捉，并以電子信號的形式進(jìn)行信息傳遞、生成反應(yīng)數(shù)據(jù)，輔助計(jì)算機(jī)設(shè)備完成活體濃度的計(jì)算。其中生物傳感器作為一項(xiàng)核心設(shè)備，憑借其跨學(xué)科交叉特征保證設(shè)備使用性能的靈敏度與精確度，將其運(yùn)用于復(fù)雜食品的微生物檢測環(huán)節(jié)，可實(shí)現(xiàn)待檢測病原微生物的快速在線實(shí)時分析與變化情況追蹤定位，滿足實(shí)際檢測要求。生物傳感器技術(shù)與酶抑制檢測技術(shù)結(jié)合，開發(fā)基于酶的生物傳感器技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對果蔬、農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的檢測。LIU等將乙酰膽堿酯酶固定在3-羧基苯硼酸-還原氧化石墨烯-納米金的玻璃碳電極上，開發(fā)了一種納米復(fù)合材料電化學(xué)酶傳感器，最終成功實(shí)現(xiàn)對克百威等農(nóng)藥殘留量的檢測[6]。

2.2.2 電阻電導(dǎo)檢測技術(shù)

該技術(shù)以生物、化學(xué)理論為基礎(chǔ)，將微生物在食品中繁殖的特性等同于大分子、小分子物質(zhì)間的轉(zhuǎn)化過程，例如通過觀察食品中含有蛋白質(zhì)分解后形成氨基酸的過程，測得培養(yǎng)液中電阻阻值出現(xiàn)變化，根據(jù)具體測量數(shù)值進(jìn)行導(dǎo)電情況的測算，由此反推出食品中所含菌落的數(shù)量，進(jìn)而完成微生物的判定工作，并且支持判斷食品保質(zhì)期。在使用該技術(shù)進(jìn)行食品檢驗(yàn)時，還需依賴微生物計(jì)數(shù)儀、全自動微生物檢定儀等測量儀器設(shè)備輔助執(zhí)行具體操作，根據(jù)電阻、電容等數(shù)據(jù)測算出微生物數(shù)量，生成切實(shí)可參考的食品檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，便于相關(guān)檢驗(yàn)人員判斷食品是否合格。

2.2.3 質(zhì)譜技術(shù)

該技術(shù)主要融合生物基因組、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多種研究理論，常被應(yīng)用于海產(chǎn)品、發(fā)酵產(chǎn)品的食品質(zhì)量檢驗(yàn)中，利用該技術(shù)可將待測樣品中的革蘭氏陽性菌進(jìn)行有效分離，并建立光譜指紋圖圖譜列表，根據(jù)種屬特異性的峰值、質(zhì)量數(shù)等指標(biāo)完成細(xì)菌鑒別與判定。例如，劉印平等運(yùn)用頂空進(jìn)樣-氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行海魚中苯系物、多溴聯(lián)苯瞇的測定，先取待測海魚作為樣品，通過90 ℃溫育后取出樣品、振蕩平衡30～40 min， 并頂空進(jìn)樣，利用色譜柱完成樣品的分離，再基于MRM與外標(biāo)法獲取最終檢測結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對海魚中苯系物含量的測定。檢測結(jié)果表明，苯系物在 3.0～85.0 μg·kg-1的濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，計(jì)算出平均回收率保持在82.8%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過9.8%，收獲理想檢測效果[7]。

2.2.4 色譜法與熒光分析技術(shù)

通常食品中細(xì)菌生長、繁殖的不同階段均表現(xiàn)出差異化生理特征，選取微生物生長代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定，即可完成細(xì)菌類型識別與繁殖時間的判斷。①利用氣相色譜技術(shù)進(jìn)行食品中大腸桿菌的測定，預(yù)先對食品中的大腸桿菌進(jìn)行衍生化處理，利用氣相色譜儀原理、參考CO2氣體生成量完成食品中微生物化學(xué)組分的判定，用于檢測出食品的細(xì)菌污染程度，其靈敏度、檢測效率均保持在較高水平。②運(yùn)用自動熒光酶分析技術(shù)對食物進(jìn)行免疫測定，將表面承載抗原的載體經(jīng)由化學(xué)反應(yīng)生成復(fù)合物抗原，在保留反應(yīng)液的基礎(chǔ)上，利用清洗劑將其他物質(zhì)進(jìn)行完全清除，隨后通過添入酶反應(yīng)底物發(fā)揮催化作用，使得產(chǎn)物依附于原有載體表面、發(fā)生變色現(xiàn)象，并且根據(jù)產(chǎn)物生成量實(shí)現(xiàn)對待測微生物含量的判定。例如，辛思培等運(yùn)用雙抗夾心化學(xué)酶聯(lián)免疫方法針對牛奶中腸出血性大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測，取1 L原奶作為樣品，依據(jù)1.0×105CFU·mL-1檢測限進(jìn)行樣品中大腸桿菌的檢測，僅需1～1.5 h即可完成待測菌種的快速測定，該方法的最低檢測限可達(dá)到2.5×104CFU·mL-1，節(jié)省傳統(tǒng)檢測技術(shù)所需的富集培養(yǎng)時間，且檢測速度與結(jié)果精度均較為理想[8]。

2.2.5 分子生物技術(shù)

（1）PCR技術(shù)。該技術(shù)適用于乳酸菌、大腸桿菌、雙歧桿菌等細(xì)菌的檢測，基于生物學(xué)原理獲取待測樣品細(xì)胞，通過將其DNA片段進(jìn)行放大觀察，遵循目標(biāo)特異性原則完成微生物的識別與定位，保證檢測過程的靈敏性與快捷性。

（2）PCR衍生技術(shù)。其中代表性技術(shù)包含實(shí)時熒光定量PCR，根據(jù)DNA擴(kuò)增反應(yīng)，選取嵌入式熒光化學(xué)染料對PCR循環(huán)后的產(chǎn)物進(jìn)行定量測試，在整體測試過程中僅在加入試樣環(huán)節(jié)開管，其他操作均呈現(xiàn)為密閉性特征，不需要執(zhí)行PCR技術(shù)模式下的后處理操作，有效實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的動態(tài)識別與實(shí)時檢測，具有良好的智能化與抗干擾水平，避免因核酸污染影響到檢測結(jié)果。PCR-DGCE作為另一代表性技術(shù)，主要根據(jù)生物學(xué)的DNA指紋原理進(jìn)行食品中微生物的識別判定，在DNA電泳過程中利用聚丙烯酰胺凝膠對產(chǎn)物進(jìn)行解鏈，改變DNA片段序列，迅速溶解DNA分子，待染色后完成不同序列DNA分子的區(qū)分，以此實(shí)現(xiàn)對目的片段序列的有效識別，適用于發(fā)酵食品的檢驗(yàn)。

3 相關(guān)建議

3.1 強(qiáng)化監(jiān)督機(jī)制建設(shè)

2021年初至今，我國陸續(xù)發(fā)布新《食品安全法》《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 較大嬰兒配方食品》（GB 10766—2021）等一系列法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)志著我國食品安全監(jiān)管體系的日臻完善。在依托法規(guī)政策強(qiáng)化頂層保障的基礎(chǔ)上，行業(yè)內(nèi)部還應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)檢測與監(jiān)督機(jī)制的建設(shè)，以微生物檢測為切入點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)應(yīng)用流程、實(shí)施要點(diǎn)與相關(guān)規(guī)范的細(xì)化設(shè)計(jì)，明確在檢測技術(shù)應(yīng)用過程中涉及的各項(xiàng)風(fēng)險因素及人為主觀影響，聚焦食品原料生產(chǎn)、加工、制作與銷售等環(huán)節(jié)落實(shí)具體監(jiān)督檢查工作，并聯(lián)系產(chǎn)業(yè)鏈上下游拓寬技術(shù)應(yīng)用范圍，引入物聯(lián)網(wǎng)等平臺建立資源與信息共享機(jī)制，為食品安全監(jiān)管工作提供有力支持。

3.2 完善食品檢驗(yàn)系統(tǒng)

當(dāng)前微生物檢測技術(shù)在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍較廣，既涉及食品工業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌種含量的檢測與鑒定，同時也包含食品原料獲取、加工等環(huán)節(jié)可能因人畜疾病傳播產(chǎn)生的有害病原微生物，此外還涉及食品運(yùn)輸與銷售環(huán)節(jié)因保存不當(dāng)、過期等產(chǎn)生的微生物，在整體檢測過程中的干擾條件較為復(fù)雜，對于檢測技術(shù)應(yīng)用水平提出較高要求?；诖耍€需進(jìn)一步完善現(xiàn)有食品檢驗(yàn)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，根據(jù)微生物不同類型、感染與傳播途徑進(jìn)行檢驗(yàn)方法、檢測標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)化分類，引入多種先進(jìn)技術(shù)、自動化儀器設(shè)備完善食品檢驗(yàn)環(huán)節(jié)的軟硬件基礎(chǔ)設(shè)施，借此有效規(guī)避以往檢驗(yàn)工作中常見的錯誤問題，為食品檢驗(yàn)結(jié)果的精確度與完整性提供保障。

3.3 落實(shí)檢驗(yàn)效果評價

評價機(jī)制的建設(shè)對于技術(shù)應(yīng)用效果判斷具有重要意義，考慮到微生物檢測技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用環(huán)節(jié)可能受多種因素干擾影響到數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，因此還需引入健全的評價機(jī)制進(jìn)行檢測項(xiàng)目類型、檢測內(nèi)容指標(biāo)、評價標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)，自動生成檢測結(jié)果，更好地提升食品檢驗(yàn)的現(xiàn)代化水平。

4 結(jié)語

現(xiàn)階段依賴于食品安全監(jiān)管機(jī)制的高壓態(tài)勢，以沙門氏菌、葡萄球菌為代表的食源性疾病在我國各省市呈現(xiàn)零散分布特征，食品安全保障工作初具成效。伴隨食品安全檢測需求的持續(xù)遞增，要求相關(guān)從業(yè)人員引入多種快速檢測技術(shù)及配套設(shè)備為執(zhí)法抽樣提供支持，在實(shí)際檢測過程中遵守操作規(guī)程、執(zhí)行規(guī)范操作，為檢測效率與檢測結(jié)果的精確性提供保障，共同營造良好食品安全環(huán)境。