張力琪，黃 珂，肖 帥，劉 清，李海鷗，蕭浪濤

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，長沙 410128）

脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族（lipid transfer proteins，LTPs）是一類富含半胱氨酸的小分子可溶性蛋白，分子量通常低于10 kD，具有4～5個α-螺旋，由8個半胱氨酸形成4個二硫鍵，一般形式為C-Xn-CXn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C［1-2］，其三級結(jié)構(gòu)中有一個貫通的疏水腔，能可逆結(jié)合單磷脂分子和蠟質(zhì)單體等多種疏水分子。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白分布廣泛且功能多樣，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的糖基磷脂酰肌醇錨定脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（glycosylphosphatidylinositol-anchored lipid transfer protein，LTPG）能影響表皮蠟質(zhì)積累［3-4］；擬南芥中的AtLTP12參與調(diào)控花粉和種子發(fā)育［5-6］；甘藍(lán)型油菜（Brassica napusL.）中的BraLTP1過表達(dá)會導(dǎo)致植株異常的綠色著色、減少葉子的蠟質(zhì)沉積，影響細(xì)胞分裂素合成基因IPT3高表達(dá)和花朵形態(tài)的變異［7］；卷心菜（Brassica oleraceaL.）中的部分LTPs有冷凍保護(hù)素的功能，能提高卷心菜的抗寒能力［8］；土豆（Solanum tuberosumL.）中的StnsLTP1過表達(dá)能顯著提高其在逆境脅迫如高溫、干旱與鹽脅迫下的生存能力［9］。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族功能多樣，其中LTP2分子量為9.6 kD，定位于細(xì)胞壁與質(zhì)膜。擬南芥ltp2突變體的黃化苗會出現(xiàn)蠟質(zhì)層發(fā)育缺陷的表型［10］；煙草（Nicotiana tabacum）中的LTP2參與細(xì)胞壁的伸長［2，11］；大麥（Hordeum vulgare）中的LTP2在擬南芥中過表達(dá)能增強(qiáng)其對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性［12］。

乙烯是一類重要的植物激素，各種植物組織在一定條件下都能產(chǎn)生乙烯。乙烯具有催熟果實、誘導(dǎo)蠟質(zhì)合成、增強(qiáng)抗逆性等諸多功能。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路始于信號感受，即乙烯分子結(jié)合到乙烯受體蛋白1（ethylene receptor 1，ETR1）的N端，隨后會解除受體與乙烯組成型三重反應(yīng)蛋白1（constitutive triple-response 1，CTR1）的結(jié)合，使乙烯不敏感蛋白2（ethylene-insensitive protein 2，EIN2）去磷酸化，繼而激活乙烯不敏感蛋白3（ethylene-insensitive protein 3，EIN3）與乙烯不敏感蛋白3類似蛋白（EIN3-like proteins，EILs），將乙烯信號傳遞到下游乙烯響應(yīng)因子（ethylene response factor，ERF），從而調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，產(chǎn)生乙烯響應(yīng)表型［13-14］。乙烯敏感性蛋白1（reversion-to-ethylene sensitivity 1，RTE1）蛋白合成受乙烯調(diào)控，通過占據(jù)ETR1的乙烯結(jié)合位點負(fù)調(diào)控下游的乙烯反應(yīng)［15］。

使用乙烯或其前體物處理植物幼苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生“三重反應(yīng)”表型，可用于鑒定植物乙烯信號通路上的基因突變［16］。乙烯的“三重反應(yīng)”是指外施乙烯或乙烯生物合成前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸（1-aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC）后，使植物產(chǎn)生頂部彎鉤卷曲程度加大、下胚軸變粗變短、根伸長受到抑制的現(xiàn)象［17］。乙烯信號通路發(fā)生基因突變會改變其“三重反應(yīng)”相關(guān)的表型，其突變體主要分為兩類：一類是組成型乙烯反應(yīng)突變體，通常是負(fù)調(diào)控因子突變激活了乙烯信號通路，如乙烯信號通路中的CTR1發(fā)生突變導(dǎo)致在無外源乙烯或ACC的條件下出現(xiàn)“三重反應(yīng)”表型；另一類是乙烯不敏感突變體，通常是由于乙烯信號通路中的正調(diào)控因子突變，導(dǎo)致在外源乙烯處理下依然不發(fā)生“三重反應(yīng)”［18-20］。

蠟質(zhì)是植物表皮最外層的重要成分，其合成途徑分為兩步：質(zhì)體內(nèi)的C16和C18?；溨舅岷铣膳c質(zhì)體外的C16或C18飽和脂肪酸延長及衍生物合成；質(zhì)體外長鏈脂肪酸合成后，通過超長鏈脂肪酸經(jīng)脫羰基途徑和?；€原途徑，最終形成各種蠟質(zhì)［21］。蠟質(zhì)合成酶CER3（eceriferum 3）參與催化烷類的合成。蠟質(zhì)合成酶CER6（eceriferum 6）是脂質(zhì)合成中超長鏈脂肪酸合成的限速酶，其突變會導(dǎo)致擬南芥的表皮蠟質(zhì)缺失［22］。研究表明，乙烯對植物表皮的蠟質(zhì)合成具有重要影響，如作為乙烯響應(yīng)因子的蠟質(zhì)誘導(dǎo)蛋白1（wax inducer 1，WIN1）能調(diào)控蠟質(zhì)合成并改變植物表皮滲透勢［23］。ltp2突變體的黃化苗下胚軸細(xì)胞壁與蠟質(zhì)層分離產(chǎn)生空隙［10］。雖然LTPs與乙烯均能單獨影響蠟質(zhì)層［10，23］，但兩者之間的關(guān)系尚未明確。

LTP1能通過與RTE1互作來調(diào)控乙烯信號通路，而ltp1突變體在ACC處理下會出現(xiàn)下胚軸比野生型更短的表型［24］；ACC處理LTP1過表達(dá)株系，植株對乙烯弱敏感，過表達(dá)植株下胚軸長于野生型。雖然LTP2突變可影響擬南芥葉片表皮蠟質(zhì)的形成與功能［10］，但LTP2是否通過乙烯途徑影響蠟質(zhì)的合成目前還不清楚。為探究LTP2是否參與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，本試驗以擬南芥Col-0和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白突變體ltp2為試驗材料，分析ACC處理后兩者的“三重反應(yīng)”表型差異，并檢測了LTP2基因、乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（RTE1、ETR1、CTR1、EIN2和EIN3）、乙烯響應(yīng)因子基因（ERF1、ERF2和ERF9）及下游蠟質(zhì)合成酶基因（CER3和CER6）的表達(dá)變化特性，初步結(jié)果表明，LTP2參與了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥Col-0與ltp2突變體。ltp2突變體購買于NASC（the EuropeanArabidopsisStock Centre，http://arabidopsis.info/），編號為SALK_026257。ltp2突變體屬于T-DNA插入突變體，插入位點位于啟動子區(qū)域，導(dǎo)致LTP2表達(dá)量大幅下調(diào)［10］。

1.2 主要試劑與儀器

ACC（S30902，1.00 g）購自源葉生物（http://www.shyuanye.com/goods-S30902.html）；MS（Murashige and Skoog culture medium）培養(yǎng)基（M8521，100 L）購自北京索萊寶科技有限公司（http://solarbio.bioon.com.cn/）；植物RNA小量提取試劑盒（R4151-02，50 Preps）購自美基生物科技有限公司（http://www.magentec.com.cn/）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AE311-03）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（http://www.transgen.com.cn/）；組織破碎儀為QIANGEN TissueLyser II；RNA和DNA濃度測定使用多功能酶標(biāo)儀（Tecan，SPARK）；熒光定量PCR（Real-time PCR）儀為BIO-RADCFX96。

1.3 方法

1.3.1 含ACC的MS固體培養(yǎng)基的配制

稱取ACC粉末0.05 g溶于1 L ddH2O配制成500μmol/L ACC母液，–20℃避光保存。使用時從母液中取1 mL溶液加入到100 mL的MS培養(yǎng)基中混勻，配制成含5μmol/L ACC的MS培養(yǎng)基，4℃避光保存，用于下一步試驗。MS培養(yǎng)基含3.0%蔗糖、0.6%瓊脂粉。

1.3.2 乙烯的“三重反應(yīng)”驗證

將Col-0與ltp2種子在75%乙醇中消毒15 min，無菌水清洗3次，懸浮于0.1%的瓊脂中，于4℃低溫條件下處理3 d。處理組將試驗材料點種在含5μmol/L的ACC、3.0%蔗糖與0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；對照組培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基與處理組相同但不含ACC。將點種后的培養(yǎng)皿密封并置于22℃黑暗條件下，4 d后觀察表型并計量數(shù)據(jù)。試驗重復(fù)3次。

1.3.3 Real-time PCR分析

將樣品收集至2 mL EP管中，加入鋼珠，使用組織破碎儀研磨成粉末，過程中保持低溫，防止樣品解凍。使用微量RNA提取試劑盒提取樣品RNA，根據(jù)RNA濃度調(diào)整反轉(zhuǎn)錄的RNA用量至500 ng。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有樣品根據(jù)OD260值（樣品在260 nm波長處光的吸收值）將cDNA濃度調(diào)整一致，進(jìn)行Real-time PCR。使用Real-time PCR檢測LTP2以及乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因（RTE1、ETR1、CTR1、EIN2和EIN3）、乙烯響應(yīng)基因（ERF1、ERF2和ERF9）以及蠟質(zhì)合成基因（CER3、CER6）的表達(dá)量。Real-time PCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5 μL、SYBR Green Master 7.5 μL、ddH2O 6.0 μL，共15.0 μL。Real-time PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共45個循環(huán)。試驗重復(fù)3次。使用qPrimerDB-qPCR引物數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）設(shè)計引物（表1），引物由擎科生物科技有限公司合成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Real-time PCR數(shù)據(jù)結(jié)果使用熒光PCR儀中BIO-RAD CFX9 manager 3.1軟件進(jìn)行分析，使用Excel 2010進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LTP2突變可弱化擬南芥黃化苗的乙烯的“三重反應(yīng)”

ACC是乙烯合成的直接前體，在研究中可通過添加ACC的方式可控地調(diào)節(jié)乙烯反應(yīng)，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確。本研究中使用添加濃度為5μmol/L ACC的MS培養(yǎng)基對擬南芥野生型（wild type，WT）與ltp2種子進(jìn)行處理。與對照組（control check，CK）表型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ACC處理后的ltp2出現(xiàn)乙烯弱敏感表型：頂部彎鉤彎曲程度小，下胚軸與根長略長于野生型，對照組中l(wèi)tp2長度與野生型無明顯差異（圖1、2）。試驗結(jié)果表明LTP2表達(dá)量下調(diào)能影響植株對乙烯的敏感程度。

2.2 擬南芥LTP2基因表達(dá)受乙烯誘導(dǎo)

Ltp2突變體中LTP2的表達(dá)量大幅下降，而在ACC的處理下突變體出現(xiàn)了乙烯弱敏感表型。為了探究ltp2突變體產(chǎn)生乙烯弱敏感表型與乙烯信號通路基因之間可能存在的聯(lián)系，我們對擬南芥野生型與ltp2突變體的相關(guān)基因進(jìn)行了Real-time PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型的LTP2基因的表達(dá)量在ACC處理后上升了77.0%，而突變體中的LTP2表達(dá)量無明顯變化（圖3）。這一結(jié)果說明LTP2表達(dá)受到乙烯的調(diào)控。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab. 1 Primers used for Real-time PCR analysis

2.3 LTP2突變影響乙烯信號通路基因的表達(dá)

圖1 ACC處理對擬南芥野生型與ltp2突變體表型的影響Fig. 1 Effect of ACC treatment on the Arabidopsis thaliana wild type and ltp2 mutant phenotype

圖2 ACC處理擬南芥野生型與ltp2突變體黃化幼苗長度對比Fig. 2 Comparison of relative length of the etiolated Arabidopsis thaliana wild type and ltp2 mutant with ACC treatment

圖3 擬南芥野生型與ltp2突變體的LTP2基因相對表達(dá)量Fig. 3 The relative expression of LTP2 gene in the Arabidopsis thaliana wild type and ltp2 mutant

LTP2突變會導(dǎo)致擬南芥材料對乙烯的敏感程度降低，從而弱化其乙烯“三重反應(yīng)”表型（圖1），而乙烯信號通路基因RTE1［15］、ETR1、CTR1［25］、EIN2［13］和EIN3［14］等產(chǎn)生突變也會引起“三重反應(yīng)”表型的變化。因此，本試驗使用ACC處理擬南芥野生型與ltp2材料，并分析兩者乙烯信號通路相關(guān)基因表達(dá)的差異。在無ACC處理時，與野生型相比，突變體中ETR1與EIN2的表達(dá)量有顯著升高，分別上升81.0%（圖4b）與87.0%（圖4d），而兩種材料RTE1、CTR1和EIN3的表達(dá)量無明顯差異（圖4a、4c、4e）；ACC處理組中，野生型RTE1表達(dá)量比突變體高96.0%（圖4a），但野生型的CTR1的表達(dá)量比突變體低23.4%（圖4c），ETR1、EIN2和EIN3表達(dá)量無明顯差異（圖4b、4d、4e）。根據(jù)表達(dá)量檢測，LTP2可能通過影響RTE1與CTR1的表達(dá)來降低乙烯反應(yīng)的敏感程度。

圖4 乙烯信號通路基因相對表達(dá)量Fig. 4 The relative expression of ethylene signaling pathway genes

2.4 ltp2突變體中乙烯響應(yīng)因子的表達(dá)量降低

乙烯響應(yīng)因子ERF位于乙烯信號通路的下游，受乙烯信號調(diào)控并調(diào)控下游乙烯效應(yīng)基因的表達(dá)，最終影響表型。ACC處理組中，野生型ERF1、ERF2和ERF9基因表達(dá)量比突變體分別高20.9%（圖5a）、100.0%（圖5b）、38.7%（圖5c）。對照組中，野生型與突變體中的ERF1、ERF2和ERF9表達(dá)量無明顯差異。從兩者在處理組中的表達(dá)量差異可以看出，在ACC處理后突變體中以上3種ERF的表達(dá)量均低于野生型，表明突變體中乙烯信號要弱于野生型。

2.5 ltp2突變體的蠟質(zhì)合成酶基因表達(dá)產(chǎn)生差別

乙烯參與調(diào)控植物表皮的蠟質(zhì)合成［23］，LTP2也參與蠟質(zhì)層的形成［10］。對相關(guān)蠟質(zhì)合成酶基因的表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)：野生型的蠟質(zhì)合成酶基因CER3［26］的表達(dá)量在ACC處理后略有降低，而突變體中則升高了56.5%（圖6a）；野生型與突變體的CER6［27］的表達(dá)量在處理組與對照組中都呈下降趨勢，但突變體中的表達(dá)量一直高于野生型（圖6b）。突變體CER3的表達(dá)量在兩組中的差別與野生型不同，與乙烯處理下CER3表達(dá)量的降低趨勢相反［28-29］，推測蠟質(zhì)的合成受乙烯與LTP2的共同調(diào)控。

圖5 乙烯響應(yīng)因子基因相對表達(dá)量Fig. 5 The relative expression of ethylene response factor genes

圖6 蠟質(zhì)合成酶基因相對表達(dá)量Fig. 6 The relative expression of the waxy synthetase gene

3 討論

使用適當(dāng)濃度的外源乙烯或其前體處理擬南芥能出現(xiàn)典型的“三重反應(yīng)”特征表型。利用這點，可以判斷研究對象是否參與調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控屬性與位點，還能研究乙烯與各類生理表型的關(guān)系。擬南芥中XBAT31基因的RNAi株系在乙烯處理下產(chǎn)生乙烯過敏感表型，而添加乙烯受體抑制劑AgNO3后，過敏感表型消失，表明XBAT31負(fù)調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)且調(diào)控處于乙烯受體上游［30］。趙宇航等［31］通過對大量煙草乙烯不敏感突變體株系的低溫處理，發(fā)現(xiàn)植物的乙烯不敏感性與低溫抗性的提高有著密切的聯(lián)系，其中的調(diào)控機(jī)制還需更深一步的研究。在本試驗中，突變體中的LTP2表達(dá)量大幅下調(diào)，在ACC處理下表現(xiàn)為乙烯弱敏感，突變體整體下胚軸和根長略長于野生型；對照組中野生型與突變體植株長度無差異。試驗結(jié)果表現(xiàn)出LTP2對乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控，LTP2表達(dá)量的下調(diào)影響了乙烯信號的傳遞。

脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白功能廣泛，擬南芥AtLTPd1的突變體atltpd1在接種丁香假單胞菌后，在其遠(yuǎn)葉中未能檢測到相關(guān)病程的基因表達(dá)，證明AtLTPd1參與植物體內(nèi)相關(guān)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［32］。在蠟質(zhì)合成方面，有報導(dǎo)顯示甘藍(lán)型油菜在ACC處理后會導(dǎo)致蠟質(zhì)中烷類含量與蠟質(zhì)總量減少［29］，其蠟質(zhì)表面密度更高，覆蓋面更光滑［33］。CER3是蠟質(zhì)合成途徑中一個重要的烷類合成酶，在某些LTP完全敲除突變體中烷類的含量減少［28，34］。本試驗中野生型的CER3和CER6在ACC處理后表達(dá)量均呈下降趨勢，符合其在乙烯處理后的基因表達(dá)改變趨勢，突變體的表達(dá)量差異證明LTP2在乙烯誘導(dǎo)蠟質(zhì)合成中有一定的作用。以上試驗結(jié)果表明LTP2參與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并影響下游響應(yīng)因子的表達(dá)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本文結(jié)果為深入研究脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白功能及其與植物激素的互作提供了新的參考依據(jù)。