茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的影響

綦國(guó)紅，張佳怡，楊志萍，陳貴堂

中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院（南京 211198）

茶多酚（tea polyphenols，簡(jiǎn)稱(chēng)TP），是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，主要化學(xué)成分為兒茶素類(lèi)（黃烷醇類(lèi)）、黃酮及黃酮醇類(lèi)、花色苷類(lèi)、酚酸類(lèi)等。其中兒茶素類(lèi)化合物為茶多酚的主要成分，占茶多酚總量的65%～80%[1]，是形成茶葉色香味的主要成分之一，也是茶葉保健功能的主要成分之一。

茶多酚是一種廣譜的抗菌劑，其對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）以及其他腸道致病菌具有不同程度的抑制和殺傷作用。茶多酚通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合使得細(xì)胞膜的通透性增加，其內(nèi)容物、金屬離子和蛋白質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致細(xì)菌代謝發(fā)生紊亂，從而產(chǎn)生直接的抗菌作用[2-3]。另外，茶多酚還能清除有害自由基，具有很強(qiáng)的抗氧化作用[4]，因此茶多酚常用于食品防腐保鮮。

金黃色葡萄球菌是人和動(dòng)物正常菌群的微生物，肉、蛋、奶及其制品常受此菌的污染[5]。并且它還能黏附在生物或非生物表面形成生物膜，來(lái)庇護(hù)該菌不受殺菌劑的作用。細(xì)菌生物膜的形成受許多因素影響，如細(xì)菌自身所處的環(huán)境因素會(huì)影響生物膜的產(chǎn)生[6-8]。試驗(yàn)研究不同環(huán)境條件下茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用，為茶多酚在生產(chǎn)上應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料、試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），實(shí)驗(yàn)室保藏。茶多酚，合肥博美生物科技有限公司；結(jié)晶紫草酸銨染色液，永安化學(xué)實(shí)驗(yàn)室出品；胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；酵母提取物，Oxoid Ltd.；氯化鈉，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；ELxTM800多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

測(cè)試菌充分活化后，按1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基，在37 ℃ 150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，至菌體密度OD600nm達(dá)到0.3左右，分裝試管。按比例加入茶多酚水溶液，使茶多酚的終質(zhì)量濃度分別為2，4，6，8，10，12和14 mg/mL，約培養(yǎng)12 h，觀察各試管中菌的生長(zhǎng)情況，判定MIC。

1.3.2 對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

參照文獻(xiàn)[9]，測(cè)試菌充分活化后，按照1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基，于37 ℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD600nm達(dá)到0.3左右時(shí)，停止培養(yǎng)。將含有不同濃度的茶多酚溶液與菌液混合，使茶多酚終濃度分別為0.5，1和2MIC，加入錐形瓶中，將0.5 cm×0.5 cm的無(wú)菌輸液管片置于錐形瓶中，于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)液，添加新鮮的LB培養(yǎng)基和茶多酚，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出輸液管片，用無(wú)菌水沖洗表面浮菌，于45 ℃干燥30 min，用0.2%的結(jié)晶紫溶液染色3 min。用無(wú)菌水洗掉多余染色劑，于45 ℃干燥30 min，將處理好的輸液管片放入96孔板中，加入200 μL無(wú)水乙醇洗脫，取出輸液管片，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處的吸光度。按照式（1）計(jì)算抑制率。

1.3.3 茶多酚在不同NaCl濃度下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，茶多酚終濃度為1MIC，NaCl終質(zhì)量濃度分別為20和30 mg/mL，并設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。

1.3.4 茶多酚在不同pH條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，將菌液pH調(diào)為3，5，7，9和11，茶多酚終濃度為1MIC，進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 茶多酚在不同溫度條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，茶多酚終濃度分別為0.5，1和2MIC，分別于28和37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 茶多酚不同添加時(shí)間對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

按1.3.2的方法，分別在0，4，8，20和30 h加入茶多酚，使終濃度為1MIC，對(duì)照組為不加茶多酚，在37℃下靜置培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC

根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，8 mg/mL茶多酚是無(wú)菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度，因此判定茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為8 mg/mL。

2.2 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

由圖1可知，當(dāng)茶多酚濃度為0.5，1和2MIC時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的產(chǎn)生具有抑制作用。經(jīng)T檢驗(yàn)，p＜0.01，差異極顯著。生物膜的抑制率分別為49.8%，66.1%和67.8%，隨茶多酚濃度升高而增大。因此，茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生具有抑制作用。

2.3 茶多酚在不同NaCl濃度條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

由圖2可知，金黃色葡萄球菌在高NaCl濃度下，生物膜形成量與空白組相比略下降但變化不大，經(jīng)T檢驗(yàn)，加鹽試驗(yàn)組與空白組相比無(wú)差異（p＞0.05）。添加茶多酚又添加NaCl的試驗(yàn)組與只加茶多酚組相比差異顯著（p＜0.05），即加鹽后茶多酚組的生物膜形成量明顯減少。金黃色葡萄球菌為耐鹽菌，在高鹽濃度條件下能夠生長(zhǎng)，但鹽的存在可以增強(qiáng)茶多酚對(duì)生物膜產(chǎn)生的抑制作用。

圖1 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用

圖2 茶多酚在不同NaCl濃度下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

2.4 茶多酚在不同pH條件下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

茶多酚水溶液在pH 2～7范圍內(nèi)較穩(wěn)定，抑菌作用效果明顯。由圖3可知，在pH 7～9范圍內(nèi)，生物膜量較大，因?yàn)榇藯l件下茶多酚的抑菌效果較弱，也是金黃色葡萄球菌適宜生長(zhǎng)的pH。當(dāng)pH為5時(shí)，生物膜產(chǎn)生量減少。當(dāng)pH為3時(shí)，生物膜產(chǎn)生量急劇下降。因此，酸性條件加強(qiáng)了茶多酚的作用效果。但pH為11時(shí)，茶多酚不穩(wěn)定，失去了抑菌作用。因此推測(cè)pH為11時(shí)，生物膜產(chǎn)量急劇下降是因?yàn)閺?qiáng)堿對(duì)該菌的抑制作用所致。

2.5 茶多酚在不同溫度下對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

經(jīng)T檢驗(yàn)，當(dāng)茶多酚為1和2MIC時(shí)，在37 ℃與28℃條件下，生物膜的形成量無(wú)明顯差異（p＞0.05）。當(dāng)茶多酚為0.5MIC時(shí)，在37 ℃與28 ℃條件下，生物膜的形成量有差異（0.01＜p＜0.05）。由此可見(jiàn)，在37 ℃與28 ℃ 2種溫度條件下培養(yǎng)，茶多酚對(duì)生物膜的形成量影響不大。但2種不同溫度條件對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響較大，37 ℃為最適生長(zhǎng)溫度，因此37℃下空白對(duì)照組的生物膜形成量明顯高于28 ℃下的空白組（圖4），且差異極顯著（p＜0.01）。

圖3 不同pH下茶多酚對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

圖4 不同溫度下茶多酚對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

2.6 茶多酚不同添加時(shí)間對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

經(jīng)T檢驗(yàn)，在0和4 h添加茶多酚，形成的生物膜量與對(duì)照相比差異極顯著（p＜0.01）；8 h及以后添加茶多酚，形成的生物膜量與對(duì)照相比差異不顯著（p＞0.05）（見(jiàn)圖5）。由此可知，加入茶多酚的時(shí)間越早，其對(duì)生物膜的抑制效果越好。隨著茶多酚加入時(shí)間的推遲，抑膜作用顯著減弱，培養(yǎng)20 h后再加茶多酚對(duì)生物膜的產(chǎn)生基本無(wú)抑制作用?？赡苁遣瓒喾又饕獙?duì)早期生物膜的形成具有抑制作用，對(duì)已經(jīng)形成的成熟生物膜的破壞效果不大。

圖5 茶多酚不同添加時(shí)間對(duì)生物膜產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)旨在測(cè)定茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的定量抑制作用以及研究不同環(huán)境因素對(duì)茶多酚抑制生物膜效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)茶多酚濃度為0.5，1和2MIC時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成有明顯抑制作用，抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)。20 mg/mL和30 mg/mL NaCl以及酸性環(huán)境可以明顯增強(qiáng)茶多酚對(duì)生物膜的抑制效果；28 ℃與37 ℃培養(yǎng)對(duì)茶多酚的抑膜作用基本無(wú)影響；加入茶多酚時(shí)間越早，其對(duì)生物膜的抑制效果越好，培養(yǎng)20 h再加入茶多酚對(duì)生物膜幾乎無(wú)抑制作用。