酶重量法-液相色譜法測(cè)定食品中總膳食纖維

余梟然 余慧劍

摘 要：本研究利用酶重量法-液相色譜法，測(cè)定含水溶性膳食纖維食品的總膳食纖維含量。采用酶重量法測(cè)定試樣中不溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF）和高分子質(zhì)量可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fiber，SDF）的含量，采用液相色譜法測(cè)定試樣的低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精（Resistant Malto Dextrin，RMD）含量。液相色譜法的方法檢出限為0.142%，定量限為0.474%，線性方程為y=1.207x+0.030，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，加標(biāo)回收率為96.6%～99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.53%～1.69%（次數(shù)n=6）。精密度試驗(yàn)以酶重量法-液相色譜法測(cè)試樣品6份，平均含量為65.78%，RSD為0.52%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度、準(zhǔn)確率高，適用于添加抗性淀粉、含低分子質(zhì)量的抗性糊精等水溶性膳食纖維的食品中總膳食纖維的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：酶重量法-液相色譜法;膳食纖維;抗性糊精

中圖分類(lèi)號(hào)：R151.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2021）28-0-04

Abstract： In this study， the enzyme gravimetric method-liquid chromatography is used to determine the total dietary fiber content of foods containing water-soluble dietary fiber. Meanwhile， the enzymatic gravimetric method is used to determine the content of Insoluble Dietary Fiber （IDF） and high molecular weight Soluble Dietary Fiber （SDF） in the sample， and the low-molecular-weight Resistant Malto Dextrin （RMD） content of the sample is determined by liquid chromatography. The detection limit of liquid chromatography method is 0.142%， the limit of quantification is 0.474%， the linear equation is y=1.207x+0.030， the correlation coefficient R2 is 0.999， the recovery rate of standard addition is 96.6%～99.7%， and the Relative Standard Deviation （RSD） is 1.53% ～1.69% （number of times n=6）. In the precision test， 6 samples are tested by enzyme gravimetric method-liquid chromatography， with an average content of 65.78% and an RSD of 0.52%. The test results show that the method has high sensitivity and accuracy， and is suitable for the determination of total dietary fiber in foods containing water-soluble dietary fiber such as resistant starch and low-molecular-weight resistant dextrin.

Keywords： enzyme gravimetric method-liquid chromatography;dietary fiber;resistant dextrin

隨著人們生活水平的提高和飲食的日益精細(xì)化，心腦血管病、糖尿病、腸道癌及便秘等現(xiàn)代“富貴病”的患病率大幅上升。與此同時(shí)，我國(guó)人口快速進(jìn)入老齡化，人們的食品消費(fèi)觀念也發(fā)生了變化，不再僅僅停留在食品的感官、風(fēng)味與口感上，而越來(lái)越注重食品的健康功能性。膳食纖維（Dietary Fiber，DF）是一種重要的功能性食品成分，其突出的潤(rùn)腸通便、調(diào)節(jié)血糖反應(yīng)、降血脂和減肥等功能正逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，已成為國(guó)際上廣泛流行的功能性健康食品配料，被稱(chēng)為繼食用糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水、礦物質(zhì)和維生素之后的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”[1-4]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)膳食纖維類(lèi)功能性食品已成為開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，故研究穩(wěn)定可靠的膳食纖維含量測(cè)定方法是保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的迫切要求。目前，測(cè)定膳食纖維的方法有酶重量法和酶重量法-液相色譜法[5-8]。酶重量法主要適用于谷類(lèi)、蔬菜、水果及其制品中總膳食纖維、可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維的測(cè)定，但并不適用于含低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精、寡果糖、低聚半乳糖、多聚葡萄糖和抗性淀粉等水溶性膳食纖維食品中總膳食纖維的測(cè)定[9-12]。筆者采用酶重量法-液相色譜法測(cè)定以抗性糊精和抗性淀粉為主要原料制得的復(fù)合纖維素產(chǎn)品中的總膳食纖維含量，對(duì)液相色譜法進(jìn)行了方法學(xué)研究，獲得了滿(mǎn)意的測(cè)定結(jié)果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

主要儀器如下：示差折光檢測(cè)器（Refractive Index Detector，RID）型高效液相色譜儀、凝膠保護(hù)柱（6.0 mm×40.0 mm，6 μm）、凝膠色譜柱（7.8 mm×300.0 mm，6 μm，2根）、高型無(wú)導(dǎo)流口燒杯（400 mL或600 mL）、坩堝、真空過(guò)濾裝置、恒溫振蕩水浴箱（室溫5～100 ℃，溫度波動(dòng)±1 ℃）、分析天平（感量0.1 mg）、馬弗爐（525 ℃±5 ℃）、烘箱（105 ℃，130 ℃±3 ℃）、干燥器、pH計(jì)、真空干燥箱、冷凍干燥箱、篩網(wǎng)（50目）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

主要試劑如下：95%乙醇、丙酮、石油醚、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、三羥甲基氨基甲烷、2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸、冰乙酸、鹽酸、熱穩(wěn)定α-淀粉酶液、蛋白酶、硅藻土、溴甲酚綠、右旋葡萄糖、麥芽糊精、85%乙醇溶液、78%乙醇溶液、0.05 mol/L MES-TRIS緩沖液、蛋白酶溶液、酸洗硅藻土、重鉻酸鉀洗液、3 mol/L乙酸溶液、0.4 g/L溴甲酚綠溶液、多氨基弱堿性離子交換樹(shù)脂（OH-型）、大孔強(qiáng)酸性苯乙烯型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（Na-型）、1%丙三醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、右旋葡萄糖和丙三醇溶液、1%麥芽糊精溶液。

1.2 供試品

自制復(fù)合纖維素顆粒（以抗性糊精、抗性淀粉為主要原料），粉碎后過(guò)50目篩，70 ℃真空干燥后置干燥器中冷卻待用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品有葡萄糖（純度≥99%）、丙三醇（純度≥99%）和抗性麥芽糊精（Resistant Malto Dextrin，RMD）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品酶解

準(zhǔn)確稱(chēng)取雙份試樣（M1和M2）各1 g，精確到0.1 mg，雙份試樣質(zhì)量差不超過(guò)0.005 g，置于400 mL或600 mL高腳燒杯中，同時(shí)制備2個(gè)空白樣用于校正試劑對(duì)測(cè)定的影響。加入0.05 mol/L MES-TRIS緩沖液40 mL，用磁力攪拌直至試樣完全分散在緩沖液中。

2.1.1 熱穩(wěn)定α-淀粉酶酶解。加100 μL熱穩(wěn)定α-淀粉酶液緩慢攪拌，然后加蓋鋁箔，置于95～100 ℃的恒溫振蕩水浴箱中持續(xù)振搖。當(dāng)溫度升至95 ℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，通常反應(yīng)35 min。將燒杯取出，冷卻至60 ℃，打開(kāi)鋁箔蓋，用刮勺將燒杯內(nèi)壁的環(huán)狀物和燒杯底部的膠狀物刮下，用10 mL蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。

2.1.2 蛋白酶酶解。向每個(gè)燒杯加入100 μL蛋白酶溶液，蓋上鋁箔，置于60 ℃±1 ℃水浴中持續(xù)振搖。當(dāng)水溫達(dá)到60 ℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)30 min。打開(kāi)鋁箔蓋，邊攪拌邊加入5 mL 3 mol/L乙酸溶液，控制試樣溫度保持在60 ℃，用1 mol/L氫氧化鈉溶液或1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至4.5±0.2（用pH計(jì)或以0.4 g/L溴甲酚綠為外指示劑）。

2.1.3 淀粉葡糖苷酶酶解。在上述溶液中邊攪拌邊加入300 μL淀粉葡萄糖苷酶液，蓋上鋁箔，繼續(xù)于60 ℃±1 ℃水浴中持續(xù)振搖，當(dāng)水溫達(dá)到60 ℃時(shí)計(jì)時(shí)反應(yīng)30 min。

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1 酶重量法。用酶重量法測(cè)定不溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF）和高分子質(zhì)量可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fiber，SDF）。

①沉淀。在每份試樣酶解液中，按乙醇與樣液體積比4∶1加入預(yù)熱至60 ℃±1 ℃的95%乙醇（預(yù)熱后體積約為225 mL），取出燒杯，蓋上鋁箔，室溫下沉淀1 h。

②過(guò)濾。取已加入硅藻土并干燥稱(chēng)重的坩堝，用15 mL 78%乙醇潤(rùn)濕硅藻土并展平，接上真空過(guò)濾裝置，抽去乙醇使坩堝中硅藻土平鋪于濾板上。將經(jīng)乙醇沉淀的試樣酶解液轉(zhuǎn)移到坩堝中過(guò)濾，用刮勺和78%乙醇將所有殘?jiān)D(zhuǎn)至坩堝中。

③洗滌。用20 mL 78%乙醇洗滌高型燒杯3次，在抽真空條件下洗坩堝中殘?jiān)?，依次用洗燒杯后?0 mL 78%乙醇洗3次，10 mL 95%乙醇洗2次，10 mL丙酮沖洗2次。向?yàn)V液中加入10 mL內(nèi)標(biāo)溶液，然后用78%乙醇溶液定容至500 mL，混勻。

④濃縮。取200 mL濾液在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用蒸餾水定容至50 mL。

⑤稱(chēng)量。將坩堝在70 ℃真空中干燥過(guò)夜。稱(chēng)量坩堝、膳食纖維殘?jiān)凸柙逋恋馁|(zhì)量，精確到0.1 mg。減去坩堝和硅藻土的質(zhì)量，計(jì)算不溶性膳食纖維（IDF）和高分子質(zhì)量可溶性膳食纖維（SDF）在乙醇中沉淀的殘?jiān)|(zhì)量。

⑥灰分的測(cè)定。取雙份試樣中的一份殘?jiān)础妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》（GB 5009.4—2016）測(cè)定試樣中的灰分。

⑦蛋白質(zhì)的測(cè)定。取雙份試樣中的另一份殘?jiān)?，按《食品安全?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）測(cè)定試樣中的蛋白質(zhì)。

2.2.2 液相色譜法。測(cè)定試樣中的低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精（RMD）的含量。

①脫鹽。在玻璃柱中加入溶脹好并充分混合的10 g OH-型多氨基弱堿性離子交換樹(shù)脂和10 g轉(zhuǎn)化為H-型的Na-型大孔強(qiáng)酸性苯乙烯型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。先用100 mL的水清洗，然后把50 mL溶液加入柱子中，再用100 mL的水洗脫，流速為0.8 mL/min。收集150 mL洗脫液，在50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加少量水轉(zhuǎn)移出來(lái)，定容至25 mL。溶液經(jīng)0.45 μm水相濾膜過(guò)濾，待液相色譜分析用。

②色譜參考條件。色譜柱采用凝膠保護(hù)?。?.0 mm×40 mm，6 μm）和2個(gè)串聯(lián)的凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm，6 μm）。流動(dòng)相為超純水，超聲脫氣30 min，流速為0.5 mL/min，柱溫為80 ℃±1 ℃。進(jìn)樣量為50 μL和100 μL。檢測(cè)器內(nèi)部溫度設(shè)定為50 ℃±1 ℃。

③樣品中抗性麥芽糊精的測(cè)定。取100 μL右旋葡萄糖和丙三醇的溶液注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定3個(gè)不同濃度的右旋葡萄糖和丙三醇峰面積值。通過(guò)計(jì)算右旋葡萄糖峰面積與丙三醇峰面積的比值（y軸）和右旋葡萄糖質(zhì)量與丙三醇質(zhì)量的比值（x軸）所得曲線的斜率的倒數(shù)，得到右旋葡萄糖的響應(yīng)因子（Response factor，RF）。

取50 μL的1%麥芽糊精溶液注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，確定色譜圖中聚合度（Degree of Polymerization，DP）不小于3的葡萄糖聚合物的保留時(shí)間。取100 μL樣液注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定試樣中DP≥3的葡萄糖聚合物響應(yīng)值（峰面積）。利用試樣中DP≥3的葡萄糖聚合物峰面積與丙三醇峰面積的比值和試樣中加入的丙三醇的量，得到抗性麥芽糊精的含量。

④檢出限?？瞻谆|(zhì)添加抗性麥芽糊精（0.5 g/100 g）溶液，在相同條件下進(jìn)樣6次，測(cè)得儀器基線噪聲為50 nRIU。

按檢出限定義，抗性麥芽糊精（RMD）在此分析條件下的檢出限數(shù)據(jù)如表1所示?？剐喳溠亢臋z出限色譜圖如圖1所示。

⑤標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制。根據(jù)《食品中膳食纖維的測(cè)定 酶重量法和酶重量法-液相色譜法》（GB/T 22224—2008）的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線只需要配制3個(gè)濃度點(diǎn)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，即10.0 mg/25 mL、20.0 mg/25 mL、50.0 mg/25 mL，內(nèi)標(biāo)溶液丙三醇的濃度為40.0 mg/25 mL，將其依次注入高效液相色譜儀。通過(guò)計(jì)算右旋葡萄糖峰面積與丙三醇峰面積的比值（y軸）和右旋葡萄糖質(zhì)量與丙三醇質(zhì)量的比值（x軸）所得曲線的斜率的倒數(shù)，得到右旋葡萄糖的響應(yīng)因子（RF），如表2所示。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖2所示，葡萄糖和丙三醇標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖3所示。所得線性方程為y=1.207x+0.030，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999，響應(yīng)因子為0.828。

⑥精密度。在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，由同一操作者使用新建的色譜定量分析方法，在較短時(shí)間間隔內(nèi)使用同一儀器對(duì)相同樣品進(jìn)行分析測(cè)定。樣品復(fù)合纖維素顆粒中水溶性膳食纖維含量、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)如表3所示。經(jīng)計(jì)算，水溶性膳食纖維檢測(cè)結(jié)果的平均值為65.78 g/100 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.34 g/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%?？瞻咨V圖如圖4所示，樣品色譜圖如圖5所示。

⑦回收率試驗(yàn)（準(zhǔn)確度）。由于復(fù)合纖維素顆粒樣品中水溶性膳食纖維含量較高（大于65 g/100 g），無(wú)法直接在此樣品中進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，因此選擇在空白基質(zhì)樣品中加入一定已知濃度的抗性麥芽糊精標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照相同的檢驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得的樣品回收率如表4所示。添加水平0.5 g/100 g下，回收率平均值為96.6%，RSD為1.53%;添加水平5.0 g/100 g下，回收率平均值為99.3%，RSD為1.57%;添加水平50.0 g/100 g下，回收率平均值為99.7%，RSD為1.69%。不同添加水平下的加標(biāo)試驗(yàn)色譜圖如圖6至圖8所示。

2.2.3 酶重量法-液相色譜法樣品測(cè)定。采用酶重量法-液相色譜法測(cè)定了6份樣品復(fù)合纖維素顆粒的水溶性膳食纖維含量，平均含量為65.78%，RSD為0.52%。

3 結(jié)語(yǔ)

采用酶重量法測(cè)定試樣中不溶性膳食纖維（IDF）和高分子質(zhì)量可溶性膳食纖維（SDF）的含量，運(yùn)用液相色譜法測(cè)定試樣中低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精（RMD）的含量。兩者結(jié)合測(cè)定了多份含低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精食品的總膳食纖維含量，RSD為0.52%，結(jié)果令人滿(mǎn)意。該復(fù)合方法靈敏度、準(zhǔn)確率高，可以用于含低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精水溶性膳食纖維食品中總膳食纖維的測(cè)定。

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