長鏈非編碼RNAs TCONS_00028652、lnc_H007 和lnc_H001在斑馬魚胚胎期的時空表達

周春娥

（河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007）

在人類基因組中只有不到2%的基因組序列編碼蛋白質(zhì)，而至少90%被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA（ncRNA）。這些ncRNA 沒有編碼蛋白質(zhì)的潛力，它們最初被認為是轉(zhuǎn)錄噪聲，被標(biāo)注為垃圾轉(zhuǎn)錄［1，2］。近年來，越來越多的證據(jù)表明它們在廣泛的 生 物 學(xué) 過 程 中 起 著 重 要 的 作 用［3～5］。目 前，ncRNA 在許多生物學(xué)過程中和人類疾病中的基因調(diào)控作用越來越受到廣泛關(guān)注。這些ncRNA 根據(jù)其在細胞中的功能大致分為2 類：管家ncRNA和調(diào)節(jié)ncRNA［6～8］。調(diào)節(jié)ncRNA 又可以進一步劃分為2 個亞類：小的ncRNA，包括研究最好的microRNA 和其它小于200 個核苷酸（nt）的ncRNA，以及長于200 個核苷酸的長鏈非編碼RNA（lncRNA）［9］。雖然lncRNA 具有5’帽子、剪切變異、poly-A 等與mRNA 類似的特征并表現(xiàn)出時空表達特性，但其功能還有待進一步闡明。

斑馬魚（Danio rerio）已經(jīng)成為一種非常流行的研究 基因和ncRNAs 功能 的模式 生物［10～14］。最近，3 項獨立的研究發(fā)現(xiàn)了一系列在斑馬魚早期發(fā)育 階 段 和 成 體 組 織中 表 達 的lncRNAs［13～15］。研究表明，lncRNAs 轉(zhuǎn)錄本在脊椎動物胚胎發(fā)生和組織維護與修復(fù)中具有潛在作用。Kaushik 等［15］從成年斑馬魚5 種組織中預(yù)測到442 條lncRNAs，其中342 條在多種組織中都有表達，而77 條主要在其中一個組織特異性表達，其中47 條在大腦中特異性表達，12 條在心臟中特異性表達，其中包括lnc_H007 和lnc_H001，12 條是血液中特異性表達，4 條是在肌肉中特異性表達，2 條是在肝臟中特異性表達。Ulitsky 等［13］從斑馬魚的3 個不同的發(fā)育階段中鑒定出550 條lincRNAs（long interveining noncoding RNAs），發(fā)現(xiàn)只有29 條在哺乳動物中存在序列保守性。Pauli 等［14］鑒定了一系列在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中表達的1 133 條lncRNA。隨后，另一項研究鑒定了813 條心臟lincRNA，其中423條是新的，564 條表達于胚胎心臟，730 條表達于成體心臟［16］。這些研究表明，lncRNAs 在胚胎發(fā)生以及組織和器官的維護中發(fā)揮著深遠的作用，但大部分lncRNAs 的功能仍不清楚。

為了研究斑馬魚成體組織中特異表達lncRNA 在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時期是否有表達并發(fā)揮一定作用，本研究選擇了3 個在成魚心臟中表達的lncRNAs 來研究其在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時空表達譜，以進一步推測其在胚胎發(fā)生、組織建成與修復(fù)中的潛在功能。

1 材料和方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

本研究所用野生型斑馬魚（AB 系）購自中國斑馬魚資源中心（CZRC）。斑馬魚養(yǎng)殖在河南師范大學(xué)藻類研究室斑馬魚自動養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫嚴格控制在28.5 °C，光周期為10 h 暗周期14 h 的光照周期。水的pH 控制在7.0～8.0，每天2 次喂食豐年蟲，對魚的一切實驗處理嚴格遵循《中華人民共和國動物衛(wèi)生法》和《動物科學(xué)實驗許可證管理辦法》（批準(zhǔn)文號：SCXK（YU）2005-0001）。

1.2 LncRNAs 來源

本研究中選擇的3 種lncRNAs，其中l(wèi)nc_H007和lnc_H001 是Kaushik 等［15］報道為心臟 特 異性表達lncRNAs，TCONS_00028652 是Wang 等［16］報道為成魚和胚胎心臟富集lncRNA。 lnc_H001、lnc_H007 和TCONS_00028652 在斑馬魚基因組上的位點分別為：chr22：38857701-38860155、chr4（reverse strand）：7407840-7407310 和chr16（reverse strand）：15786804-15786237，而且均為單外顯子，其外顯子長分別為341、531、568 bp。其中l(wèi)nc_H001 在斑馬魚lncRNA 數(shù)據(jù)庫ZFLNC［17］和zflncRNApedia［18］有收錄 ，ID 號分別為ZFLNCT18991 和 ZF_lnc001202。 TCONS_00028652 在lncRNA 數(shù)據(jù)庫NOCODE 中有收錄，ID 號為NONDRET003276。與人lncRNA 相比，斑馬魚lncRNA 研究還比較少，因此在lncRNA 數(shù)據(jù)庫收錄的寥寥無幾。

1.3 LncRNAs 的編碼潛能的預(yù)測及基因組位點的生物信息學(xué)分析

通 過CPAT［19］（http：//lilab. research. bcm.edu/cpat/）和CPC［20］（http：//cpc2. cbi. pku. edu.cn/）2 個 在 線 軟 件 以 及NCBI 上ORFfinder 對lncRNAs 的蛋白編碼潛能進行預(yù)測。另外根據(jù)lncRNAs 在基因組的位點通過Ensemble 網(wǎng)站分析其與蛋白編碼基因的關(guān)系（圖1）。

1.4 收集斑馬魚胚胎和成魚組織

收集胚胎的前1 天，在光照期結(jié)束前1～2 h 喂斑馬魚。把1 條雌斑馬魚和2 條雄斑馬魚轉(zhuǎn)移到塑料孵化盒中。第2 天從塑料孵化盒中收集受精卵。將胚胎轉(zhuǎn)移到胚胎孵化液中（19.3 mM NaCl，0.23 mM KCl，0.13 mM MgSO47H2O，0.2 mM Ca（NO3）2，1.67 mM Hepes［pH7.2］）在28.5 °C 條件下進行孵化，胚胎發(fā)育按照Kimmel 等［21］描述的方法通過受精后小時數(shù)（hpf）來分期，并按照Westerfield 等［22］所描述 程序來收集8 個階段的胚胎（2、6、12、24、36、48、60、72 hpf）。選取2～3 月大的成體斑馬魚，通過解剖獲得8 種組織（大腦、心臟、肝臟、脾、腎、肌肉、鰓和眼），并把各時期的胚胎和不同組織儲存在-80 °C 冰箱中備用。

1.5 RNA 提 取 和cDNA 合 成

利 用RNAiso Plus（TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd. 中國）從每個階段的50 個胚胎以及不同組織提取總RNA。 用Nanodrop-2000 測定總RNA 的濃度和純度?？俁NA 含量由260 nm 處的吸光度計算，RNA 純度由A260/A280 的比值（＞1.8）進行驗證。

用HIFIScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（Cwbiotich，中國）把1 μg 總RNA 反錄成cDNA，具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。3 個lncRNAs 在胚胎不同發(fā)育時期以及不同組織中的相對表達水平通過qPCR 進行檢測，以β-actin 作為內(nèi)參。qPCR 的反應(yīng)條件如下：95 °C 預(yù)變性10 min，95 °C 變性10 s，54～60 °C 退火30 s，共40 個循環(huán)。采用熔融曲線法進行PCR 鑒定。使用2-ΔΔCt計算方法［23］進行分析。所有引物均由中國金唯智生物公司合成，引物如表1 所示。

表1 qPCR 和原位雜交所用到的LncRNAs 引物Table 1 The primers of lncRNAs in qPCR and in situ hybridization assays

1.6 整胚原位雜交

為研究這3 個lncRNAs 在不同胚胎發(fā)育時期的空間表達模式，用4%多聚甲醛固定胚胎。通過PCR 從cDNA 中擴增出3 個lncRNAs 序列（Cwbiotich，China），并克隆到TA 載體（Invitrogen，USA）。lncRNA 用ApaI 或NsiI 線性化，用sp6 或T7 RNA 聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備用地高辛（DIG）標(biāo)記的反義RNA 探針（DIG RNA 標(biāo)記試劑盒，羅氏，德國），進行全胚原位雜交，具體操作方法如Thisse 等［24］所述。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，采用spss13.0進行最小顯著性差異測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNAs 的編碼潛能及生物信息學(xué)分析

根據(jù)2 個在線軟件CPAT 和CPC 預(yù)測蛋白編碼能力發(fā)現(xiàn)，它們都沒有編碼能力，在NCBI 的ORFFinder 也確定它們不編碼蛋白質(zhì)。根據(jù)它們在基因組上的位置發(fā)現(xiàn)，TCONS_00028652 沒有與任何蛋白編碼基因重合，它是非蛋白基因si：dkey-111b4.2 的產(chǎn)物，根據(jù)lncRNA 的起源以及與蛋白基因的關(guān)系［25］進行分類的方法，其屬于基因間lncRNA（lincRNA）（圖1A），其只有一個568 bp外顯子，通過在外顯子兩側(cè)的側(cè)翼序列設(shè)計引物，通過PCR 克隆出1 092 bp 的片段，將得到的PCR產(chǎn)物送往金維智測序并將序列通過NCBI blast 進行比對，進一步證明此長鏈非編碼RNA 確實存在。Lnc_H001 在基因組的位點與蛋白編碼基因LO016987.1 的第5 個外顯子和第6 個外顯子之間的內(nèi)含子重疊，且轉(zhuǎn)錄方向相同，并與蛋白編碼基因LO016987.2 的第44 和45 外顯子之間的內(nèi)含子重疊，且轉(zhuǎn)錄方向相反（圖1B）。根據(jù)LncRNA 的分類方法H001 屬于內(nèi)含子型。H007 所在的基因位點與Tnni4a-206 的第7 個外顯子的非編碼區(qū)重疊，第7 個外顯子共長4 012 bp，有87 bp 為編碼區(qū)，3 925 bp 為非編碼區(qū)，并與之轉(zhuǎn)錄方向相反（圖1C），因此根據(jù)lncRNA 的分類方法H007 為反義lncRNA 或3’UTR 型。

圖1 LncRNAs 與蛋白編碼基因的關(guān)系Fig.1 The correlation between lncRNAs and protein genes

2.2 qPCR 檢測3 種lncRNAs 在斑馬魚胚胎不同發(fā)育時期和不同組織中的表達

為研究3 種lncRNAs 在胚胎發(fā)育過程中和不同組織中的表達模式，選擇8 個不同發(fā)育階段的胚胎和從成魚解剖獲得的8 個不同的組織進行qPCR。結(jié)果3 個lncRNAs 在不同胚胎發(fā)育階段都有表達（圖2A～圖2C），它們同時在不同的組織也都有表達（圖2D～圖2F）。其中TCONS_00028652在大腦和肝臟中的表達高于其它組織，lnc_H001則在大腦中的表達高于其它組織，而lnc_H007 是在心臟中的表達高于其它組織。因此，盡管這些lncRNA 是從成魚心臟中鑒定出來的，但是它們在其它組織中也有一定的表達，并且在不同的胚胎發(fā)育階段也都有表達，可以推測這些lncRNAs 不僅在心臟建成和修復(fù)中發(fā)揮一定的作用，可能在其它組織的建成和修復(fù)過程中，以及斑馬魚胚胎發(fā)育過程也起著非常重要的作用。

2.3 通過全胚原位雜交檢測lncRNAs 在斑馬魚胚胎不同發(fā)育時期的空間定位

為確定這些lncRNAs 在胚胎不同發(fā)育階段中的空間表達模式，使用地高辛標(biāo)記的反義RNA 探針對lncRNAs 進行了全胚原位雜交。結(jié)果表明，TCONS_00028652 在各個階段的表達水平均高于lnc_H001 和lnc_H007（胚胎被染顏色為深藍），與qPCR 結(jié)果一致（與內(nèi)參基因的表達比較可知）。TCONS_00028652 從0 hpf 就有表達，到后期主要在大腦和尾部表達（圖3）。同樣，lnc_H007 和lnc_H001 則主要在大腦中表達（圖4、圖5）。這3種lncRNAs 都在大腦中有表達，可能在胚胎神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮一定的作用。

圖2 qPCR 檢測3 個長鏈lncRNAs 在斑馬魚不同發(fā)育時期和不同組織中的表達Fig.2 LncRNAs expression during differential developmental stages and different tissues

圖3 全胚原位雜交檢測TCONS_00028652 在斑馬魚不同發(fā)育時期的表達Fig.3 TCONS_00028652 expression during differential embryonic developmental stages

圖4 全胚原位雜交檢測lnc_H001 在斑馬魚不同發(fā)育時期的表達Fig.4 Lnc_H001 expression during differential embryonic developmental stages

3 討論與結(jié)論

與有關(guān)lncRNA 在疾病尤其是癌癥中的作用和分子調(diào)控機制的研究有大量文獻報道相比，發(fā)育中的lncRNA 的作用尚缺乏相關(guān)的證據(jù)。了解lncRNA 在發(fā)育過程中的功能和調(diào)控機制有利于揭示疾病的分子機制，可為探索疾病的治療開辟道路。最近，在斑馬魚和小鼠中發(fā)現(xiàn)了一些與發(fā)育 相 關(guān) 的lncRNA［26，27］，表 明lncRNA 在 發(fā) 育 相 關(guān)的生物學(xué)過程中對基因調(diào)控產(chǎn)生了實質(zhì)性的影響。其中包括一些在參與心血管發(fā)育的lncRNAs，例如tie-AS參與了血管發(fā)育過程中基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［28］，并通過體內(nèi)外核糖核酸蛋白結(jié)合實驗研究發(fā)現(xiàn)，tie-AS通過與RNA 結(jié)合蛋白Elavl1結(jié)合來進行調(diào)控tie1mRNA 水平［29］。心血管發(fā)育需要bvht，bvht激活心臟血管基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［30］。Fendrr在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出組織特異性表達，對小鼠心臟和體腔壁的正常發(fā)育至關(guān)重要［31］。其它3 種與心血管相關(guān)的lncRNAs（TERMINATOR、ALIEN和PUNISHER）也被發(fā)現(xiàn)，分別在未分化多能干細胞、心血管祖細胞和分化內(nèi)皮細胞中特異表達，它們參與了脊椎動物和人類心血管的發(fā)育［32］。還有一些與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的lncRNAs 也 相繼被證 實，如cyrano［33，34］，durga［35］等。還有研究證明malat1對斑馬魚胚胎汞化合物污染做出應(yīng)答，并有望作為斑馬魚胚胎汞化合物污染的lncRNA 標(biāo)志物［36］。

圖5 全胚原位雜交檢測lnc_H007 在斑馬魚不同發(fā)育時期的表達Fig.5 Lnc_H007 expression during differential embryonic developmental stages

本研究首先對3 個lncRNAs 的蛋白編碼潛能進行了預(yù)測，它們都沒有編碼能力，然后通過Ensemble 網(wǎng)站，根據(jù)它們所在的基因組位點分析它們與蛋白基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TCONS_00028652 沒有與任何蛋白基因重疊，為基因間lncRNA。lnc_H001 位于蛋白編碼基因LO016987.1和LO016987.2的內(nèi)含子區(qū)，為內(nèi)含子lncRNA。lnc_H007 則與蛋白編碼基因tnni4a-206的第7 個外顯子的非編碼區(qū)重疊，定義為反義型lncRNA 或3’UTR。通過定量PCR 和全胚原位雜交ISH 結(jié)果均表明，這3 種lncRNAs 在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中按照一定的時空模式表達，推測它們可能參與胚胎的發(fā)育，通過不同組織qPCR 結(jié)果證明它們不僅在心臟中有表達，在其它組織也或多或少的有表達。Kaushik 等［15］報 道lnc_H001 是在成體心臟中特異性表達，但本研究在胚胎早期中的不同結(jié)果表明，在大腦中表達最高，提示lnc_H001 在胚胎期神經(jīng)發(fā)育中過程發(fā)揮一定的作用，而在成體斑馬魚中則主要在心臟建成與修復(fù)中發(fā)揮功能。lnc_H007 的表達結(jié)果與Kaushik 的結(jié)果一致，TCONS_00028652 則在大腦和肝臟中的表達要高于在心臟及其它組織，而Wang 等［16］報道其為心臟富集lncRNA，原因可能是Wang 所用的材料為胚胎心臟，成魚心臟和成魚的肌肉，并沒有選擇大腦和肝臟作為材料。這樣的結(jié)果正如Kaushik 的推測，在胚胎發(fā)育過程中表達的lncRNAs 在成魚組織中也存在差異表達，反之亦然，一些預(yù)測組織限制性表達的lncRNAs 在胚胎發(fā)生過程中各發(fā)育器官也略有表達。例如，WISH 數(shù)據(jù)還顯示，預(yù)測的大腦限制性表達的lncRNAs，如lncBrHM_035 和lncBrM_002 在斑馬魚24 hpf 胚胎的眼睛、中腦和后腦中均表現(xiàn)出明顯的定位。這些證據(jù)表明，大多數(shù)lncRNA 可能在不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮多種功能，大多數(shù)lncRNAs 更傾向于在多個組織中表達，而不是局限在一個組織中表達，暗示同一個lncRNA 可能在多個生物學(xué)過程中起調(diào)節(jié)基因表達的作用，但其分子功能和機制有待進一步研究。

本研究表明，這3 種在成魚心臟中發(fā)現(xiàn)的lncRNAs 在多個胚胎發(fā)育階段以及包括成體大腦、心臟在內(nèi)的多個器官中均有表達。這一結(jié)果可以推測它們可能在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中、心臟及其它器官的建成及修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但是它們的分子功能和機制還需進一步的研究。