生大黃粉治療新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型腸損傷的實(shí)驗(yàn)研究*

馮愛(ài)民，謝秀春，吳夏穎，于 瑛，王 苗，郭小霞，羅世杰，張 卉

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，陜西 咸陽(yáng) 712000

胃腸功能障礙在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室發(fā)生比例高［1］，是新生兒疾病加重的表現(xiàn)之一，同時(shí)被認(rèn)為是多器官功能障礙的始動(dòng)因素［2］，其中缺氧、嚴(yán)重感染及早產(chǎn)是導(dǎo)致新生兒胃腸功能障礙的中心環(huán)節(jié)［3-4］。新生兒胃腸功能障礙無(wú)特異治療方法，臨床上采取綜合治療方案，給予禁食、胃腸減壓等措施，生大黃在成人胃腸功能障礙中［5-6］、大兒童疾病中應(yīng)用相對(duì)成熟［7-8］，但用于新生兒疾病報(bào)道相對(duì)較少［9-10］。本課題將腸損傷新生大鼠作為研究對(duì)象，觀察生大黃粉灌胃后治療組臨床表現(xiàn)、腸道病理組織變化及炎性介質(zhì)血小板激活因子（PAF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）值的變化，初步探討中藥生大黃粉與新生大鼠腸損傷之間的關(guān)系，為腸損傷進(jìn)一步防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生2 日齡大鼠，雌雄不限，體重5～10 g，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品及試劑

生大黃粉（陜西中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供）；早產(chǎn)兒配方奶（雀巢特別能恩）：每100 g粉末含蛋白質(zhì)14.4 g，脂肪25.9 g，碳水化合物53.2 g，熱量2108 KJ；蛋白粉（G20140134，廣東湯臣倍健生物科技公司）：每100 g 粉末含蛋白質(zhì)80 g；脂肪乳（中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液C14-24，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030609，華瑞制藥有限公司）：含大豆油20 g，卵磷脂1.2 g，甘油2.2 g，能量840 KJ；脂多糖（LPS，西安灝洋生物技術(shù)有限公司）：10 mg/支；大鼠PAF ELISA 檢測(cè)試劑盒（RA20040，上海橋杜生物科技有限公司）；大鼠IL-6ELISA 檢測(cè)試劑盒（RA20064，上海橋杜生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

新生鼠保育箱（自制）：可控溫度、濕度；灌胃器（重慶渝科實(shí)驗(yàn)耗材公司）：幼鼠專用6號(hào)5 cm彎針頭、7號(hào)5 cm直針頭和1 ml 注射器組成；缺氧箱（自制，密閉塑料泡沫箱）：有出入氣孔各一；醫(yī)用氮?dú)猓ㄅ鋫鋬?chǔ)氣罐及氮?dú)饬髁勘?，咸?yáng)市秦虹氣體制造有限公司）：純度≥99.9%；醫(yī)用氧氣（陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制氧站）；便攜式數(shù)字測(cè)氧儀（CY-12C，建德市梅城電化分析儀器廠）等。

1.4 分組、造模及給藥

取新生大鼠60 只，按照隨機(jī)表法分為ABCDEF 共6組：A 組空白對(duì)照組、B組造模組、C組生理鹽水組、D 組生大黃大劑量組、E 組生大黃中劑量組、F 組生大黃小劑量組，其中D、E、F 三組稱為治療組，每組10 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1天。

按照文獻(xiàn)造模［11-12］，每組均灌胃混合奶粉喂養(yǎng)，每次0.2 ml，間隔6 小時(shí)1 次，每天每次增加0.05 ml。往缺氧箱內(nèi)注入100% 氮?dú)猓∟2），應(yīng)用測(cè)氧儀測(cè)得箱內(nèi)氧濃度為0，將除A 組外余50 只新生大鼠放入缺氧箱內(nèi)90 秒，取出后再放入40%～80%復(fù)氧箱中給予2分鐘吸氧，之后將其放入4℃冰箱冷刺激，10 分鐘后取出，每天2 次，同時(shí)每組下午灌胃脂多糖(LPS) 0.1 ml(10 mg/g),每天1次，連續(xù)3天。B組作為模型組，不給予治療；冷刺激后治療組：D組、E組、F 組分別灌胃大黃粉液0.1 ml，C 組灌胃生理鹽水0.1 ml，均每日3 次，間隔8 小時(shí)1 次，連續(xù)3 天，出現(xiàn)溢乳、拒乳、腹脹或排黑色血便，提示造模成功。

根據(jù)小嬰兒生大黃用量［13-14］，按體表面積法［15］換算成大鼠用藥量。大劑量組灌胃生大黃粉2 675.4 mg/kg/d,0.1 ml 相當(dāng)于28 mg；中劑量組1 337.7 mg/kg/d，0.1 ml 相當(dāng)于14 mg；小劑量組668.8 mg/kg/d，相當(dāng)于7 mg。代乳品參考Barna 等報(bào)道配制［16］，稱取早產(chǎn)兒配方奶5 g、蛋白粉10 g，脂肪乳50 ml，加入約80℃滅菌水至100 ml，每日配奶1 次，置于4℃冰箱冷藏保存，每次灌胃前置于60℃溫水中溫?zé)幔瑹峥s5 254 kJ/L，相當(dāng)于母鼠奶熱卡。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5 臨床觀察、病理切片及指標(biāo)檢測(cè)

每日8 時(shí)稱量并記錄各組新生大鼠體質(zhì)量，隨時(shí)觀察其一般狀況：精神反應(yīng)、活動(dòng)、對(duì)刺激反應(yīng)、膚色、進(jìn)食、腹脹、嘔吐及大小便性狀等。第5 天所有新生大鼠于最后1次喂養(yǎng)完成后空腹12小時(shí)，用頸椎脫臼法處死，并置于無(wú)菌操作臺(tái)上，立即清潔并用75%酒精消毒腹部皮膚，以清潔眼科剪自腹正中線打開(kāi)腹腔，眼科鑷仔細(xì)分離腸系膜及血管后取出十二指腸下端至回盲部腸管，留取回盲部近端腸管上下各約1 cm腸組織，平鋪并用紗布包裹后放入十二指腸下端至回盲部余腸組織，放入冷生理鹽水中漂洗、濾紙拭干稱重、在冰水環(huán)境下加入9 倍生理鹽水，研磨腸組織勻漿、離心，取上清液，放置于-80℃冰箱中，采用ELISA 雙抗夾心法檢測(cè)腸組織PAF、IL-6 含量，嚴(yán)格按酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 腸組織病理評(píng)分

采用Khailova 等［17-18］的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腸組織損傷評(píng)分。腸道絨毛和上皮完整，組織結(jié)構(gòu)正常，記0 分；輕微黏膜下和(或) 固有層腫脹分離，記1 分； 中度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或)肌層水腫，記2 分；重度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或)肌層水腫，局部絨毛脫落，記3 分；腸道絨毛消失伴腸壞死，記4 分。每張切片觀察3 個(gè)視野，取平均值，評(píng)分≥2 分診斷壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均輸入計(jì)算機(jī)，采用SPSS 20.0 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理與分析。所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用Kruskal-WallisH 檢驗(yàn)。結(jié)果的顯著性以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

除A 組空白對(duì)照組外，余各組放入缺氧箱后新生鼠相繼出現(xiàn)煩躁、呼吸困難、發(fā)紺、全身青紫、大小便失禁、反應(yīng)遲鈍，甚至呼吸暫停。復(fù)氧后新生鼠逐漸恢復(fù)自主活動(dòng)，膚色轉(zhuǎn)紅，但各組需時(shí)間不一樣，治療組需時(shí)間短，復(fù)氧需幾十秒或1 min 左右，造模組、生理鹽水組需時(shí)間長(zhǎng)，約3 min；之后將其置于4℃冰箱冷刺激，計(jì)時(shí)10 min后取出，新生鼠出現(xiàn)全身皮膚冰冷，膚色發(fā)白，立即置于保育箱保暖，治療組膚色不足1 min恢復(fù)，B組、C組約2～3 min 膚色恢復(fù)。A 組活動(dòng)自如，無(wú)腹瀉、溢奶、膚色紅潤(rùn)。造模組B 組、鹽水對(duì)照組C 組第2～3 天不同程度表現(xiàn)精神差、活動(dòng)少、溢乳、排褐色大便、膚色偏暗稍干燥。中藥大中小劑量組各組活動(dòng)、反應(yīng)可，奶量能完成，膚色紅稍干燥，小劑量組有2 例排褐色大便，大劑量組有4 例排黃色稀水便。

2.2 體重情況

實(shí)驗(yàn)前各組體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后B、C、D、E、F各組與空白對(duì)照A組比較，體重均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中B 組與C 組體重下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D、E、F 各治療組與B組、C 組比較，體重均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 生大黃粉對(duì)腸損傷組織中PAF和IL-6含量的影響

B、C組與A 組比較，PAF、IL-6含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D、E、F 各治療組與B、C 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D、E、F 各治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2

表1 新生鼠實(shí)驗(yàn)前后體重增加情況（±s）

表1 新生鼠實(shí)驗(yàn)前后體重增加情況（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別A組（空白對(duì)照組，n=10）B組（模型對(duì)照組，n=10）C組（生理鹽水組，n=10）D組（生大黃大劑量組，n=10）E組（生大黃中劑量組，n=10）F組（生大黃小劑量組，n=10）FHP實(shí)驗(yàn)前體重（g）10.55±0.70 10.74±0.79 10.71±0.74 10.95±0.73 10.88±0.71 11.00±0.78 0.528-0.754實(shí)驗(yàn)后體重（g）13.8±1.05 9.95±0.87a 9.99±0.75a 11.16±0.84abc 11.12±0.73abc 11.22±0.77abc 27.720-0.000體重增加值(g)3.25±0.58-0.79±0.40a-0.72±0.23a 0.21±0.35abc 0.23±0.12abc 0.22±0.14abc-48.047 0.000

表2 生大黃粉對(duì)腸損傷組織中PAF和IL-6含量的影響

2.4 腸組織損傷病理評(píng)分結(jié)果

造模組、生理鹽水組均有腸損傷表現(xiàn)，大中小劑量組腸損傷程度與造模組、生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且大多居于1～2分，與空白組比較，仍有腸道損傷發(fā)生，見(jiàn)表3、圖1。

表3 腸組織損傷病理評(píng)分

3 討論

圖1 腸損傷病理切片

本實(shí)驗(yàn)選用新生大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，模擬人類新生兒胃腸功能常見(jiàn)誘因［3］，給予缺氧、復(fù)氧、冷刺激及脂多糖灌胃制作腸損傷模型，大體解剖腸腔擴(kuò)張，病理切片提示：粘膜下層、固有層腫脹分離，粘膜下層、肌肉層水腫，局部腸絨毛脫落、消失或壞死，表明新生鼠腸損傷造模成功。實(shí)驗(yàn)后造模組、生理鹽水組較空白對(duì)照組體重下降，生大黃大中小劑量組較造模組、生理鹽水組體重增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理切片提示造模組、生理鹽水組腸粘膜損傷幾乎100%，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后者無(wú)腸道損傷表現(xiàn)，排除因灌胃導(dǎo)致腸道損傷；與生大黃大中小劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示生大黃粉能減輕或防治新生大鼠受到缺氧等刺激時(shí)胃腸道損傷。病理切片結(jié)果與臨床表現(xiàn)基本一致，缺氧、冷刺激后各組均表現(xiàn)膚色發(fā)紺、精神反應(yīng)差，但復(fù)氧時(shí)治療組相對(duì)空白對(duì)照組、造模組各組不良癥狀消失快，膚色恢復(fù)快。本實(shí)驗(yàn)生大黃大中小劑量組腸道損傷病理切片表現(xiàn)無(wú)明顯差異，可能表示生大黃療效與在一定范圍能與劑量關(guān)系不大，需進(jìn)一步明確。

從胃腸功能障礙產(chǎn)生機(jī)制看，缺氧、感染可直接導(dǎo)致腸黏膜損傷，同時(shí)產(chǎn)生許多細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)參與，其中血小板因子（PAF）是大多數(shù)的細(xì)胞及組織產(chǎn)生的一種磷脂炎癥介導(dǎo)因子，該因子可以導(dǎo)致人體上皮細(xì)胞受到損傷甚至凋亡，促使白細(xì)胞和血小板聚集，引起血管收縮并使得血管的通透性增加［19-20］。 實(shí)驗(yàn)表明［21］, 注射大劑量PAF, 大鼠可迅速發(fā)生腸壞死，壞死一般呈局灶性, 可累及空腸、回腸(尤其是遠(yuǎn)端回腸)和/或盲腸。IL-6 是許多細(xì)胞因子中其一，是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)腸道的損傷作用主要通過(guò)活化淋巴細(xì)胞、誘導(dǎo)B 細(xì)胞分泌和誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞分化、催化并放大炎癥反應(yīng)和毒性作用，并有調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的能力，造成腸道等組織細(xì)胞損傷［22-23］。

周于新等［24］實(shí)驗(yàn)報(bào)道生大黃具有與腸三葉因子相同的防治NEC的效果，能減少缺氧腸損傷組織中腫瘤壞死性因子（TNF-a）及丙二醛(MDA)的產(chǎn)生,具有相同的保護(hù)缺氧性腸黏膜損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)造模組、生理鹽水組腸組織PAF、IL-6 與空白組比較明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，喂藥大中小劑量組較造模組、生理鹽水組顯著下降，提示灌胃生大黃可能通過(guò)降低應(yīng)激腸道組織PAF、IL-6 水平，從而減輕全身炎癥反應(yīng)，對(duì)腸道組織及全身起保護(hù)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。

初生兒先天稟賦不足，尤其表現(xiàn)為脾常不足，失于運(yùn)化，中焦氣機(jī)阻滯，加之腹中穢物未下凈，失于通降，而致胃腸積滯。新生兒胃腸功能障礙其病因雖為脾胃虛弱，但依據(jù)“急則治其標(biāo)”的原則，當(dāng)以腑氣不通為主要矛盾，胃及大小腸皆屬于“腑”，“腑以通為順”，治療上應(yīng)以消積導(dǎo)滯，逐穢通腑為法。生大黃是傳統(tǒng)的中草藥，具有清熱解毒、宣通氣機(jī)、通里攻下、活血化瘀的作用［25］，其下積滯、行瘀結(jié)的功效正好與新生兒胃腸功能障礙腑氣不通、氣滯血瘀的病機(jī)相契合；新生兒大鼠中醫(yī)證型多樣化，本研究主要從大鼠腑氣不通、氣滯血瘀型討論，與其他證型的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

本研究表明生大黃粉灌胃能降低新生大鼠腸損傷模型中腸組織PAF、IL-6 水平，同時(shí)能減輕或避免腸組織病理改變。由此推測(cè)，生大黃對(duì)胃腸功能障礙腸黏膜損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控炎性因子來(lái)減輕腸道的炎癥反應(yīng)，提示生大黃粉可能是防治新生兒胃腸功能障礙的藥物，鑒于生大黃成分多，靶點(diǎn)多，其作用機(jī)制與其有關(guān)成分的關(guān)系及其他相關(guān)因子的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。生大黃大中小劑量組對(duì)腸損傷病理切片改善無(wú)明顯差異，提示生大黃治療劑量范圍相對(duì)較廣，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，生大黃粉灌胃對(duì)新生兒大鼠腸粘膜損傷有保護(hù)作用，與空白組比較，仍有腸道損傷發(fā)生，故生大黃粉不能完全預(yù)防缺氧、寒冷、感染等刺激導(dǎo)致的腸道粘膜損傷，需進(jìn)一步研究探討。