黃瑩琳，張 志,2，張洪亮,2，胡 博,2，龍海濤*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室, 廣州 510631；2. 華南師大(清遠(yuǎn))科技創(chuàng)新研究院有限公司，清遠(yuǎn) 511517)

植物激素脫落酸(ABA)在植物生命周期的各種生理過程中起著至關(guān)重要的作用，包括種子休眠、發(fā)芽和對環(huán)境脅迫條件的適應(yīng)性反應(yīng)[1-2]. 當(dāng)植物面臨干旱、鹽、滲透等脅迫時，植物體內(nèi)的ABA快速增加，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài). 植物中ABA水平取決于其生物合成、分解、運輸、轉(zhuǎn)化、貯存和利用，其中無生理活性的結(jié)合型ABA葡萄糖酸酯(ABA-GE)水解成具有生理活性的游離型ABA也至關(guān)重要，關(guān)系到ABA對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié). 這個步驟由植物的ABA特異性β-葡萄糖苷酶(簡稱BG或BGLU)將無活性的ABA-GE水解后形成活性的ABA[3]. 目前，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)4個β-葡萄糖苷酶(AtBG1、AtBG2、BGLU10、BGLU18)都能催化ABA-GE轉(zhuǎn)變成ABA[4-5]. 玉米基因組中具有26個編碼β-葡萄糖苷酶的基因，信號肽的分析顯示它們分別定位于質(zhì)體、線粒體、胞質(zhì)和液泡[6].

β-葡萄糖苷酶參與植物對脅迫的快速響應(yīng)，通過提高ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)可提高植物對非生物脅迫的耐受性. 有報道指出：bglu18擬南芥突變體延遲了脫水誘導(dǎo)的ABA積累[5]. 水稻Os3BGlu6可以在體外將ABA-GE水解為ABA，水稻缺失Os3BGlu6的突變體植株矮小，葉片ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和光合作用速率降低導(dǎo)致水稻抗旱性下降[7]. 過表達(dá)BG1匍匐翦股穎ABA水平積累高，導(dǎo)致植株矮生并提高了干旱存活率[8]. AtBG1通過其對氣孔發(fā)育的負(fù)調(diào)控來確保正常的氣孔密度，還可以快速形成活性ABA以適應(yīng)水分虧缺[9].

課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)：在花生響應(yīng)干旱脅迫時，有6個β-葡萄糖苷酶家族基因的表達(dá)水平顯著提高，對維持ABA穩(wěn)態(tài)發(fā)揮作用[10]，但具體機(jī)制尚不清楚. 本文根據(jù)花生響應(yīng)干旱的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，從花生中克隆了BG基因(命名為AhBG1)，將其在擬南芥異源表達(dá)，研究其對ABA敏感性和抗旱性的影響，為認(rèn)識AhBG1的功能提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 擬南芥培養(yǎng)

在超凈工作臺中用75%乙醇處理擬南芥種子40 s，再用無水乙醇處理2次，每次40 s，轉(zhuǎn)移到含有1/2 MS固體培養(yǎng)基上. 在4 ℃避光層積處理2 d后，置于光下培養(yǎng)7 d. 待幼苗長出后移栽到高溫滅菌的泥炭土生長.

1.2 序列分析及預(yù)測

基于NCBI的Blast和GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)對cDNA和其編碼氨基酸序列進(jìn)行了分析. 使用TMHMM 2.0對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/)，用SignalP 4.1 server分析信號肽.

1.3 AhBG1蛋白的亞細(xì)胞定位觀察

取約10片未抽薹的擬南芥嫩葉片，酶解法提取原生質(zhì)體，將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，在擬南芥室溫23 ℃避光孵育13～24 h，然后用激光共聚焦顯微鏡Leica LSM Image Browser 3.2 program(Leica Corporation, Germany)進(jìn)行拍照觀察.

1.4 ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

用HPLC儀(日本島津Shimadzu LC-6A)測定，以Sigma公司ABA樣品為標(biāo)準(zhǔn)品，用10 μL ABA樣品注入Kromasil C18柱，設(shè)置柱溫為35 ℃，流動相為V(甲醇)∶V(1%乙酸)=45∶55，流速1 mL/min. 檢測器Waters 486 detector，檢測波長為252 nm. 繪制ABA標(biāo)準(zhǔn)曲線. 取同一葉位的葉片0.3 g，采用同樣的參數(shù)根據(jù)峰面積計算出樣品每克干質(zhì)量的內(nèi)源ABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.5 ABA敏感性分析

參照GE等[11]方法. 將Col-0野生型和AhBG1過表達(dá)擬南芥株系種子分別鋪板于含有不同 ABA濃度的1/2 MS培養(yǎng)基，層積處理2 d 后置于光下培養(yǎng)，統(tǒng)計萌發(fā)率. 光下培養(yǎng)8 d后觀察不同濃度ABA的平板上子葉生長狀況，統(tǒng)計子葉變綠率.

1.6 擬南芥幼苗干旱存活率統(tǒng)計

將Col-0野生型和過表達(dá)AhBG1擬南芥植株正常培養(yǎng)至3周齡后停止供水21 d，再復(fù)水培養(yǎng)7 d，觀察并分析擬南芥幼苗的生長狀態(tài)并統(tǒng)計存活率.

1.7 葉片失水率分析

取正常生長條件下培養(yǎng)3周齡的擬南芥蓮座葉放于培養(yǎng)皿，置于光照培養(yǎng)箱(28 ℃，60%相對濕度)中, 每隔30 min稱量葉片質(zhì)量(m)，計算葉片失水率. 計算公式如下：

葉片失水率(%)=(m0-mt)/m0×100%，

其中，m0為葉片放進(jìn)培養(yǎng)箱時的質(zhì)量，mt為tmin后葉片的質(zhì)量.

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù)3次，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 使用Microcal Origin 7.5軟件作圖.

1.9 基因表達(dá)檢測

提取擬南芥RNA，用PrimeScriptTM one step RT-PCR kit試劑盒反轉(zhuǎn)得到cDNA. 根據(jù)已知的基因序列，設(shè)計RealTime PCR引物(表1)，按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMII說明書進(jìn)行Real Time PCR. PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s (退火溫度取決于不同引物的最適反應(yīng)溫度)，共50個循環(huán). 利用2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達(dá)量.

表1 相關(guān)基因表達(dá)所用的引物Table 1 The primers for related gene expression

2 結(jié)果與分析

2.1 AhBG1的氨基酸序列分析

氨基酸序列的多重比對分析表明：AhBG1與擬南芥AtBG1、AtBG2、水稻Os3BG6的同源性分別是8.88%、8.63%和9.77%. TMHMM 2.0分析預(yù)測表明：AhBG1的二級結(jié)構(gòu)中含有1個跨膜結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋氨基酸結(jié)構(gòu)位于7～24氨基酸位點(圖1A). 使用SignalP 4.1 server在線分析發(fā)現(xiàn)其第1～第28氨基酸位點具有信號肽(圖1B).

圖1 花生AhBG1的生物信息學(xué)分析

2.2 AhBG1轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選和AhBG1蛋白定位

利用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子與AhBG1基因及綠色熒光蛋白基因eGFP融合，將P35S∶∶AhBG1-eGFP在擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中瞬時表達(dá)，使用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)AhBG1基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2A). 通過農(nóng)桿菌EHA105將AhBG1基因的過表達(dá)載體p35S∶∶AhBG1-eGFP異源轉(zhuǎn)化到擬南芥中，篩選獲得3個AhBG1超表達(dá)擬南芥株系(圖2B)，根據(jù)AhBG1基因表達(dá)從高到低命名為AhBG1-OX-1、AhBG1-OX-2和AhBG1-OX-3. 激光共聚焦顯微鏡觀察AhBG1過表達(dá)陽性擬南芥株系根尖有綠色熒光，AhBG1-eGFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光，確定AhBG1蛋白確實定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2C).

2.3 過表達(dá)AhBG1對擬南芥植株體內(nèi)ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和ABA敏感性的影響

ABA是響應(yīng)干旱脅迫的重要應(yīng)激激素. 對AhBG1-OX-1、AhBG1-OX-2、AhBG1-OX-3和Col-0野生型擬南芥植株脫水處理2 h，檢測葉片中ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化. 在正常生長條件下，AhBG1-OX-1株系擬南芥體內(nèi)的ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于野生型，脫水處理2 h后，各株系擬南芥的ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著增加，其中過表達(dá)擬南芥中ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高顯著高于野生型，特別是AhBG1-OX-1株系擬南芥的ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(圖3). 說明AhBG1的過表達(dá)可能促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)ABA-GE生成ABA，有利于適應(yīng)干旱脅迫.

圖2 AhBG1轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和AhBG1蛋白定位

圖3 脫水處理下AhBG1轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型葉片ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

將Col-0野生型和AhBG1-OX-1株系擬南芥種子分別鋪板于含有0.1 、0.5 、2.0 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基，層積處理后統(tǒng)計萌發(fā)率. 在0.1、0.5、2.0 μmol/L ABA處理下AhBG1-OX-1株系擬南芥種子萌發(fā)率均低于Col-0野生型(圖4A). 種子正常萌發(fā)后，將AhBG1-OX-1株系和Col-0野生型擬南芥植株移入含有不同濃度ABA的平板上生長8 d，觀察子葉生長狀況. 結(jié)果表明：在0.5 μmol/L ABA的生長條件下，AhBG1-OX-1株系擬南芥的子葉變綠率低于Col-0野生型(圖4B、C). 以上ABA處理后的實驗結(jié)果說明，在擬南芥中異源過表達(dá)AhBG1基因提高轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和對外源ABA的敏感性.

圖4 AhBG1-OX-1株系擬南芥對外源ABA 的敏感性分析

2.4 過表達(dá)AhBG1對擬南芥耐旱性的影響

ABA是植物響應(yīng)干旱的關(guān)鍵激素之一，因此本研究對3周齡的AhBG1-OX-1、AhBG1-OX-2、AhBG1-OX-3株系和Col-0野生型擬南芥植株停止供水21 d，再繼續(xù)復(fù)水7 d. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AhBG1-OX-1、AhBG1-OX-2和AhBG1-OX-3株系擬南芥的存活率均高于Col-0野生型，其中AhBG1-OX-1株系擬南芥存活率最高(圖5A、B). 在脫水處理30～300 min期間，AhBG1-OX-1株系擬南芥葉片失水率持續(xù)顯著低于Col-0野生型(圖5C)，表明AhBG1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐旱性增強(qiáng).

圖5 AhBG1轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性分析

2.5 脫水處理對過表達(dá)AhBG1擬南芥體內(nèi)ABA穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的影響

檢測干旱情況下過表達(dá)AhBG1擬南芥中ABA穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)變化. 正常情況下，在AhBG1-OX-1株系擬南芥中，AtRD29A表達(dá)高于Col-0野生型(表達(dá)量增加5.2倍，圖6C)，而AtAREB1、AtNCED3、AtCYP707A1、AtUGT71C5基因的表達(dá)與野生型擬南芥無顯著變化. 脫水2 h后，在AhBG1-OX-1株系和Col-0野生型中AtNCED3、AtCYP707A1、AtAREB1和AtRD29A等基因的表達(dá)皆上調(diào)，AtUGT71C5基因的表達(dá)下調(diào)(圖6). 其中，在AhBG1-OX-1株系中AtNCED3、AtAREB1和AtRD29A基因表達(dá)增幅顯著高于Col-0野生型，而AtCYP707A1表達(dá)增幅顯著低于Col-0野生型. 結(jié)果也與脫水處理下AhBG1-OX株系和Col-0野生型葉片ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化結(jié)果相吻合.

圖6 脫水處理下AhBG1-OX-1株系和Col-0野生型葉片ABA穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)變化

3 討論

ABA穩(wěn)態(tài)是指植物自我調(diào)節(jié)并保持其內(nèi)部游離型ABA含量相對穩(wěn)定的一種狀態(tài)，受到植物體內(nèi)ABA生物合成、氧化代謝、可逆糖基化、轉(zhuǎn)運等調(diào)控[12]. 外界環(huán)境脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)ABA水平的動態(tài)變化，以調(diào)控植物水分平衡、影響體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)、提高細(xì)胞耐受性來提高植物的抗旱能力. HAN等[5]指出,植物在干旱脅迫下，體內(nèi)ABA含量的增加首先來自于ABA-GE的水解. 這引起研究人員對植物體內(nèi)ABA特異性β-葡萄糖苷酶功能的研究.

我們從花生的數(shù)據(jù)庫中篩選并克隆的AhBG1，與擬南芥的AtBG1與AtBG2氨基酸序列同源性較低，具有信號肽和跨膜區(qū)域. AtBG1和AtBG2分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[4]和液泡[13]. 本研究發(fā)現(xiàn)AhBG1定位在細(xì)胞質(zhì)(圖2)，推測其作用可能不同于AtBG1和AtBG2，有待進(jìn)一步研究. 另外，組織特異性檢測表明花生根、莖和葉片中AhBG1均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)水平最高，與擬南芥BGLU18在葉中高水平表達(dá)一致[14]，經(jīng)干旱處理時，花生中AhBG1表達(dá)增加(未發(fā)表)，表明AhBG1在花生葉片響應(yīng)干旱過程可能發(fā)揮重要作用.

β-葡萄糖苷酶提高植株體內(nèi)ABA水平從而促進(jìn)植株的抗旱性[4-5,7-8]. 過表達(dá)AtBG1擬南芥在正常條件下的葉片和根部ABA水平略增加，在脫水條件下ABA含量增加了20倍，從而表現(xiàn)出對干旱的耐受性[4]，水稻Os3BGlu6的過表達(dá)提高了水稻的耐旱性[7]. 而T-DNA插入突變體Atbg1表現(xiàn)為對干旱敏感.bglu10突變體擬南芥在干旱處理下葉片失水率較高，ABA含量和β-葡萄糖苷酶活性較低，最終導(dǎo)致耐旱性降低[19]. 過表達(dá)AhBG1擬南芥在干旱條件下體內(nèi)的ABA水平顯著高于野生型(圖3)，使其提高了ABA的敏感性和抗旱性.

9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是ABA生物合成的關(guān)鍵酶[15-16]，除ABA生物合成外，分解代謝是控制細(xì)胞ABA水平的主要過程. 細(xì)胞色素P450家族的4個成員CYP707A1至CYP707A4進(jìn)行羥化反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的8′-羥基ABA[17]. ABA通過ABA UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)與葡萄糖結(jié)合，生成無生理活性的ABA-GE[2]. AtABRE1是ABRE依賴性的ABA信號激活因子，是ABA信號通路過程的關(guān)鍵正調(diào)控因子，可增強(qiáng)擬南芥干旱耐受性[18]. 脫水2 h后，在AhBG1-OX株系中AtNCED3、AtAREB1和AtRD29A基因表達(dá)增幅顯著高于Col-0野生型，而AtUGT71C5、AtCYP707A1表達(dá)增幅顯著低于Col-0野生型(圖6). 表明同等條件的脫水處理，更能誘導(dǎo)AhBG1-OX-1株系A(chǔ)BA生物合成途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)ABA糖基化途徑基因和分解代謝途徑基因下調(diào)，同時控制氧化代謝途徑基因上調(diào)程度，從而有利于促進(jìn)植物體內(nèi)ABA積累，提升過表達(dá)植株的抗干旱能力. 因此，AhBG1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，可能通過催化ABA-GE形成ABA，從而提高植物體內(nèi)的ABA含量，并影響ABA生物合成、分解代謝及信號通路等相關(guān)穩(wěn)態(tài)基因的表達(dá)提高植物體的耐旱性.