解笑宸 于斐 姚粵峰 林健靜 年夢圓 曾暉

（北京大學深圳醫(yī)院骨關節(jié)科，骨科生物材料國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東深圳 518036）

第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chro?mosome 10,PTEN），位于人染色體10q23.3[1]，是一個由8個內含子和9個外顯子構成的200 kb的基因，是繼p53基因后研究較多的一種具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，與腫瘤發(fā)生密切相關[2]。其翻譯后產(chǎn)生的蛋白質屬于酪氨酸磷酸酶家族成員，分子量58～60 kDa，由N末端、C2結構域及C末端組成[3]。PTEN基因的最初發(fā)現(xiàn)是因為其通過磷酸酯酶作用行使抑癌基因的功能，從而調控細胞周期，影響到細胞的生長與分裂，并抑制其過快的增殖分裂[4]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)PTEN基因在骨關節(jié)炎[5]、周圍神經(jīng)損傷[6]、骨肉瘤[7]及軟骨發(fā)育不全[8]等疾病中起重要作用，其可以通過Wnt[9]、PI3K/AKT[10]、NF-κB[11]等信號轉導通路影響機體中細胞炎性因子相關免疫反應[12]、細胞凋亡[13]、神經(jīng)元軸突再生[14]等過程參與到骨科疾病[15]的病理生理過程中，也因此PTEN基因受到骨科醫(yī)師的重視。

RSC96施萬細胞系是由原代培養(yǎng)的大鼠施萬細胞經(jīng)過長時間培養(yǎng)后自發(fā)轉化形成的，傳代次數(shù)較多，該細胞在特定因子的刺激下能夠表現(xiàn)出原代施萬細胞的特性，并且能夠快速的分裂增殖，滿足細胞實驗中細胞量使用較大的需求，在創(chuàng)傷骨科、脊柱外科等領域的神經(jīng)相關疾病的研究中應用廣泛[16,17]，比如在脊髓損傷[18]、周圍神經(jīng)缺損[19]研究中受到青睞。

目前，慢病毒轉染敲減細胞中的基因表達是研究中比較新穎并且可靠的方法。通過細胞模型的建立，能夠在細胞層面結合功能及機制檢測方法解釋疾病發(fā)生發(fā)展的原因，從而為實驗研究提供便利，為臨床治療提供相應靶點。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，PTEN基因表達降低的RSC96施萬細胞系模型鮮有報道，通過建立該細胞模型，結合細胞系可以多次傳代的優(yōu)勢，我們可以在施萬細胞系中探討PTEN基因敲減通過相關信號通路如PI3K/AKT/mTOR、wnt/β-catenin等影響施萬細胞的增殖及凋亡情況，進而解釋脊髓損傷、周圍神經(jīng)缺損的發(fā)生發(fā)展原因，尋找促進損傷修復的方法及可能機制。因此，本研究應用慢病毒轉染技術敲低了RSC96施萬細胞系中PTEN基因的表達，為研究骨科疾病提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

RSC96施萬細胞系（中科院上海細胞庫提供），質粒提取試劑盒（TIANGEN公司提供），引物（上海吉凱基因科技有限公司、GeneRay公司提供），Taq Plus DNA聚合酶（Vazmye公司提供），NormalRunTM250 bp-II DNA Ladder（GeneRay公司提供），Top10感受態(tài)細胞（Genechem公司提供），T4 DNA連接酶（Thermo Scien?tific公司提供），限制性核酸內切酶（NEB公司提供），GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Scientific公司提供），293T細胞（上海細胞所提供），HIV-1 p24 Antigen ELISA 2.0試劑盒（北京達科為生物技術有限公司提供），吉凱轉染試劑（上海吉凱基因科技有限公司提供），DMEM（Corning公司、Hyclone公司提供），胎牛血清（Ausbian公司、上海微科生化試劑有限公司提供），嘌呤霉素（Clontech公司、Sigma公司提供），胰酶（生工生物工程（上海）股份有限公司提供），DMSO（上海試一化學試劑有限公司提供），臺盼蘭（Sigma公司提供），D-Hanks（上海吉凱基因科技有限公司提供），SYBR Master Mixture（TAKARA公司提供），RNA酶抑制劑（Promega公司提供），oligo dT（上海生工提供），M-MLV試劑盒（Promega公司提供），Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer試劑盒（廣州銳博公司提供），dNTPs（pro?mega公司提供），Trizol（上海普飛公司提供）。

1.2 RNAi慢病毒載體構建

引入吉凱基因的AgeⅠ、EcoRⅠ兩個酶切位點（酶切體系見表1），體系配好吹打均勻并短暫離心，37℃反應3 h或過夜，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。針對PTEN基因序列，根據(jù)RNAi序列設計原則，設計一條大鼠PTEN-RNAi靶點序列AACCCACCACAGCTAGAACTT，GC含量47.62%，Start Pos.為280；對照插入序列TTCTCCGAACGTGT?CACGT。采用吉凱基因GV248（框架結構hU6-MCSUbiquitin-EGFP-IRES-puromycin）載體構建PTENRNAi-a和PTEN-RNAi-b兩條目的基因框架，以及CON-RNAi-a和CON-RNAi-b兩條對照基因框架（表2）。合成好的引物干粉溶于退火液，90℃水浴15 min，冷卻至室溫。T4DNA連接酶于16℃1～3 h或過夜連接退火雙鏈DNA和載體。產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞，陽性克隆的菌落通過PCR進行鑒定（PCR引物：+5’CCATGATTCCTTCATATTTGC3’；-5’ AT?GTCCTTCTGCTGATACTGGG 3’）。測序后進行質粒抽提，合格的質粒用于后續(xù)實驗。

表1 酶切體系

1.3 RNAi慢病毒包裝

取培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中的生長良好的293T細胞，于轉染前2 h更換為無血清培養(yǎng)基；無菌離心管中加入制備的各DNA溶液（含有GV載體質粒20 μg、pHelp1.0載體質粒15 μg、pHelp2.0載體質粒10 μg），與一定體積的吉凱轉染試劑相混合，調整總體積為1 ml，室溫溫育15 min；滴加至293T細胞中混勻，于5%CO2、37℃下培養(yǎng)6 h；PBS洗滌轉染混合物；10%FBS、5%CO2、37℃下培養(yǎng)2～3 d；收集細胞上清液于4℃、4000g離心10 min；0.45 μm濾器過濾；含病毒的上清液于Beckman超速離心機中4℃、25000 rpm離心2 h；棄上清加病毒保存液重懸；10000 rpm離心5 min后分裝；對慢病毒進行物理狀態(tài)、無菌、病毒滴度檢測。病毒滴度計算公式為：病毒滴度=熒光細胞數(shù)/病毒原液量。

表2 PTEN-RNAi及對照構建框架

1.4 細胞感染

取生長狀態(tài)良好的RSC96細胞，鋪12孔板，3～5×104個細胞/孔，待細胞長至20%時進行轉染，細胞分為空白組、陰性對照慢病毒轉染組、PTEN-RNAi慢病毒轉染組3組，感染復數(shù)（multiplicity of infection,MOI）為5或10，感染增強液Eni.S輔助感染。感染16 h時換液，感染72 h時進行熒光拍照。

1.5 熒光定量PCR反應檢測RSC96細胞中慢病毒轉染后PTEN基因mRNA的表達情況

以GAPDH為內參基因，收集細胞用Trizol裂解液裂解，加入氯仿靜置10 min，12800 rpm、4℃離心15 min，取上層液體加入異丙醇4℃靜置10 min，12800 rpm、4℃離心15 min棄上清，75%乙醇洗滌，11800 rpm、4℃離心5 min棄上清，11800 rpm、4℃離心5 min再次棄上清，室溫干燥，RNA-free水溶解沉淀，分光光度計測RNA質量及濃度。1 μl Oligo dT（0.5 μg/μl）和2 μg總RNA加RNA-free水配成10 μl溶液，離心后于70℃溫育10 min，冰育退火，用Promega M-MLV試劑盒配置反轉錄體系，42℃水浴1 h，70℃水浴10 min，cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。按RNA PCR體系配置溶液，二步法完成擴增，采用2-ΔΔCt法開展數(shù)據(jù)分析，引物序列見表3。

表3 PTEN及GAPDH引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法

所有計量資料采用均數(shù)±標準差表示，不同組別樣本之間采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)分析應用SPSS 21.0軟件。

2 結果

2.1 PTEN基因RNAi慢病毒載體的制備及鑒定

轉化感受態(tài)細胞后的陽性克隆菌落PCR電泳結果見圖1。在本模型建立過程中，連接入慢病毒短發(fā)夾狀RNA（vshRNA）片段的陽性克隆PCR片段大小為534 bp，空載體克隆PCR片段大小為500 bp，通過軟 件 讀 取 可 知，ccggAACCCACCACAGC?TAGAACTTttcaagagaAAGTTCTAGCTGTGGT?GGGTTtttttg序列插入正確，PTEN-RNAi框架可用。

圖1 陽性克隆電泳鑒定

2.2 攜帶PTEN基因的慢病毒包裝及滴度鑒定

將PTEN-RNAi慢病毒質粒轉染293T細胞，作用1 d后，熒光顯微鏡下觀察293T細胞中熒光表現(xiàn)情況（圖2）。根據(jù)病毒滴度計算公式得，該慢病毒的滴度為8E+8TU/mL。

2.3 攜帶PTEN基因的慢病毒的質量檢測

細胞中若存在支原體、衣原體、細菌、真菌或內毒素等病原微生物時，會對細胞產(chǎn)生不利影響，從而影響實驗結果。為了避免這些病原微生物的作用，我們采用NESTPCR檢測支原體，采用培養(yǎng)法檢測衣原體、細菌和真菌，采用LAL法檢測內毒素，結果顯示PTEN-RNAi慢病毒中支原體、衣原體、細菌、真菌和內毒素均為陰性，可以用于后續(xù)實驗。

2.4 攜帶PTEN基因的慢病毒感染RSC96細胞

圖2 PTEN-RNAi慢病毒轉染293T細胞（200×）

RSC96施萬細胞鋪12孔板后，當細胞長到20%進行轉染。用病毒滴度為8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒轉染，當MOI為10時，使用慢病毒1.25μl；當MOI為5時，使用慢病毒0.625 μl。用病毒滴度為1E+9TU/mL的陰性對照慢病毒轉染，當MOI為10時，使用慢病毒1μl；當MOI為5時，使用慢病毒0.5 μl（圖3、4）。轉染后的RSC96施萬細胞生長狀態(tài)良好，無污染，可用于后續(xù)實驗。

2.5 攜帶PTEN基因的慢病毒感染RSC96細胞后細胞中PTEN基因mRNA的表達情況

通過RT-PCR檢測RSC96施萬細胞中PTEN基因的敲減情況。陰性對照慢病毒轉染組和PTENRNAi慢病毒轉染組均感染3次，陰性對照慢病毒轉染組PTEN基因mRNA的表達情況分別為1.0067±0.1370、1.0023±0.0886、1.0043±0.1141，PTEN-RNAi慢病毒轉染組PTEN基因的表達情況分別為0.2533±0.0185、0.2177±0.0186、0.2257±0.0200，3次感染均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。感染3次后，計算3次平均值作為RSC96細胞中PTEN基因的相對表達量，PTEN基因的相對表達量在陰性對照慢病毒轉染組為1.0044±0.0022，在PTEN-RNAi慢病毒轉染組為0.2322±0.0187，敲減效率為76.78%，兩組之間有統(tǒng)計學差異（P＜0.01，圖5）。由此可知，我們設計的AACCCACCACAGCTAGAACTT靶點序列是一個有效的靶點序列，成功建立起慢病毒介導的PTEN基因表達降低的RSC96施萬細胞系模型。

3 討論

PTEN基因又被稱為TEP1（TGF-regulated and epithelial cell-enriched phosphatase）和MMAC1（mu?tated in multiple advanced cancer 1），編碼由403個氨基酸組成的具有雙重磷酸酶活性的蛋白質，可通過拮抗酪氨酸激酶等抑制腫瘤發(fā)生，是一種研究廣泛的抑癌基因。MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路是調控PTEN基因的關鍵通路[20]，此外，Wnt、NF-κB等通路也能受到PTEN基因的影響，在各種生理病理過程中起到作用[21]。PTEN基因對細胞功能影響較大，可以調節(jié)多種細胞的細胞周期，并通過調控細胞遷移及凋亡影響細胞壽命，進而發(fā)揮抑癌功能[22]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在腦缺血[23]、纖維化[24]、銀屑病[25]等疾病中也起到作用，可以說參與了臨床上多個科室多種疾病的過程，也因此受到研究者的重視。

圖3 MOI為10時PTEN-RNAi慢病毒轉染RSC96施萬細胞（200×）

圖4 MOI為5時PTEN-RNAi慢病毒轉染RSC96施萬細胞（200×）

圖5 PTEN基因mRNA的表達情況

在骨科領域，PTEN基因也發(fā)揮了重要作用。Huang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA Mir-26a-5p可以通過PTEN/PI3K/AKT信號通路的作用影響纖維細胞的增殖、侵襲和凋亡，進行調控類風濕性關節(jié)炎的發(fā)展；Zhang等[27]則認為，小分子RNA Mir-130a可以通過上述通路調節(jié)軟骨細胞的增殖，減輕骨關節(jié)炎的病情。Lugo等[28]應用PTEN基因條件性敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦中PTEN基因敲除后，骨骼骨質疏松，更容易發(fā)生骨折。Li等[29]則發(fā)現(xiàn)，MYB因子誘導下上調小分子RNAMir-363-3p后，可以在PTEN基因相關通路的影響下調節(jié)骨質疏松癥的過程。此外，PTEN基因在大鼠周圍神經(jīng)發(fā)育及損傷修復中起到重要作用[30]，參與了急性脊髓損傷中軸突生長和功能的恢復[31]。由此可知，PTEN基因可以作為臨床上治療各種骨科疾病的潛在靶點。

RSC96施萬細胞系是一種在骨科領域應用廣泛的細胞[32]，尤其是創(chuàng)傷骨科、脊柱外科、手外科領域。在一般的細胞研究中，所用的細胞量是較多的，使用原代施萬細胞需要較長的培養(yǎng)周期，限制了研究的進展，而應用RSC96施萬細胞系則可以彌補這些不足，該細胞不僅保留了原代施萬細胞的特征，還能夠進行多次傳代，培養(yǎng)條件也比原代施萬細胞簡單[33]。我們通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，敲減PTEN基因的RSC96施萬細胞模型鮮有報道，因此設計了本研究，建立PTEN基因表達降低的RSC96施萬細胞系模型。

病毒作為基因轉染中的一種工具，具有良好的特性，其可以將自身攜帶的目的基因整合到宿主細胞的DNA分子上，從而使重組的DNA分子可以隨細胞分裂而穩(wěn)定地遺傳下去，在細胞系中形成一種穩(wěn)轉株。目前常用的病毒載體主要有三種：慢病毒、腺病毒和重組腺相關病毒[34]。本研究使用的是慢病毒，該病毒是在人類免疫缺陷I型病毒（human immunode?ficiency virus-1，HIV-1）基礎上發(fā)展起來的一種單鏈RNA病毒，可插入最大約10 kb的外源基因片段。慢病毒既可以轉染分裂細胞，也可以轉染非分裂細胞，對原代培養(yǎng)的細胞轉染效率也較高，有較好的優(yōu)勢。本課題組在前期研究中，通過慢病毒轉染建立了SIRT1基因表達降低的ATDC5細胞模型[35]，并在此基礎上發(fā)現(xiàn)ATDC5細胞中SIRT1基因表達降低可以通過抑制Wnt信號通路造成該細胞退變[36]。Liu等[37]應用慢病毒轉染技術將骨肉瘤細胞中BTF3基因沉默，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞的增殖受到抑制。也有研究者將慢病毒介導的microRNA-26a轉染骨髓間充質干細胞造成細胞中小分子RNA過表達，將其用于小鼠顱骨缺損修復，取得了良好的效果[38]。由此可知，慢病毒轉染技術在骨科領域應用廣泛。

我們在研究中設計了大鼠PTEN基因的RNAi特異性序列，并用吉凱基因的GV248載體將其連接，成功構建了PTEN-RNAi框架，并將其包裝成慢病毒后感染RSC96施萬細胞，感染后的細胞狀態(tài)良好，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照病毒轉染組相比，PTEN-RNAi慢病毒轉染后，RSC96施萬細胞中PTEN基因的表達量明顯降低，敲減效率達76.78%。建立該細胞模型后，我們可以在其基礎上對周圍神經(jīng)損傷后效應器與中樞相互作用的重塑過程進行深入研究，或者探討干預分子靶點促進脊髓損傷后的修復進程的可能性，為進一步了解PTEN基因在這些過程中的作用及可能機制做鋪墊，從而最終為臨床治療相關疾病尋找新的分子靶點。

本研究也有不足之處，首先，采用的RSC96細胞為細胞系，這與原代細胞有所區(qū)別，細胞系雖能多次傳代，但與來源于生物體本身的原代細胞的生長分裂情況不同，所得的研究結果需要進一步分析或在原代細胞、動物層面進行驗證后才能得到更加準確的結論。其次，缺少在此細胞模型上的深入機制研究，當然這也為我們進一步的研究內容提供了方向。

綜上所述，本研究成功設計出一條可用于PTEN基因干擾的RNAi序列，并包裝成滴度及轉染效率均較高的慢病毒，將其轉染RSC96施萬細胞后，成功構建了PTEN基因表達降低的RSC96施萬細胞系模型，為我們團隊及其他研究者應用細胞模型研究PTEN基因敲減在骨科疾病發(fā)生發(fā)展中的功能及通過相關信號通路促進疾病修復的實驗奠定了良好的基礎。