不同成熟期烤煙主脈中膜脂過(guò)氧化及其與衰老相關(guān)基因的關(guān)系探究

范寧波, 周俊學(xué), 江凱, 王宏, 史龍飛, 高玉龍, 陳頤

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 鄭州 450002; 2.河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司, 河南 洛陽(yáng) 471000; 3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 昆明 650031)

烤煙是一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[1]。在影響煙葉質(zhì)量的諸多因素當(dāng)中，煙葉的成熟度占據(jù)著首要地位，好的成熟度才能夠保證烤后煙葉的良好品質(zhì)及可用性[2]。煙草的成熟過(guò)程也是衰老過(guò)程，目前關(guān)于植物衰老的各種學(xué)說(shuō)有自由基衰老學(xué)說(shuō)、內(nèi)源激素調(diào)節(jié)學(xué)說(shuō)和細(xì)胞程序性死亡學(xué)說(shuō)等，其中最被認(rèn)可的為自由基衰老學(xué)說(shuō)[3]，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為植物衰老的過(guò)程即活性氧代謝失調(diào)、不斷積累的過(guò)程[4]?；钚匝跏巧矬w新陳代謝產(chǎn)生的一大類副產(chǎn)物，它的代謝失衡與膜質(zhì)過(guò)氧化是生物衰老的重要原因[5]。煙葉的成熟度不同，其活性氧的積累差異很大[6]，采收成熟度是影響煙葉可用性的重要指標(biāo)[7-8]?；钚匝蹙哂袠O高的活性和毒性，會(huì)對(duì)一些生物大分子物質(zhì)(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等)產(chǎn)生氧化破壞，使有毒物質(zhì)積累增加，甚至引起細(xì)胞死亡[9]。因此，對(duì)烤煙成熟過(guò)程中活性氧及膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物積累進(jìn)行研究，對(duì)煙葉的成熟采收具有重要意義。關(guān)于煙草葉片的活性氧研究已有不少，活性氧的積累也經(jīng)常被用作煙草抗逆能力的衡量指標(biāo)[10-12]。植物的衰老是一個(gè)受多基因調(diào)控的積極調(diào)節(jié)過(guò)程。煙草中NtCP1和NtCP2是編碼半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP1是一個(gè)高度衰老特異表達(dá)基因，只在自然衰老的煙草中表達(dá)，具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，不容易被外界環(huán)境所影響；NtCP2在成熟的煙草葉片中表達(dá)，但在衰老葉片中表達(dá)下調(diào)，且容易被逆境脅迫所影響，二者是煙草中常見的與衰老有關(guān)的基因[13]。由于煙草的工業(yè)用途，關(guān)于煙葉的研究一般都集中在葉片中，而對(duì)于煙葉主脈的研究卻很少，關(guān)于煙葉在成熟和衰老過(guò)程主脈中活性氧等物質(zhì)的變化更是尚未見報(bào)道。葉脈對(duì)于植物葉片的水分運(yùn)輸和生長(zhǎng)至關(guān)重要[14-15]，并且煙草的葉片主脈可以有效影響煙葉的烘烤品質(zhì)，因而煙葉主脈對(duì)于煙草品質(zhì)的影響更加深遠(yuǎn)[16-17]。本研究以烤煙品種‘K326’和‘豫煙6號(hào)’為試驗(yàn)材料，研究采后煙葉主脈中的活性氧、膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物積累以及相關(guān)衰老基因表達(dá)規(guī)律，旨在從主脈的角度來(lái)衡量煙葉的成熟狀況，從而為煙葉的成熟采收提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年在河南省洛陽(yáng)市洛寧縣煙葉標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)示范田進(jìn)行，選用當(dāng)?shù)刂髟钥緹熎贩N‘K326’和‘豫煙6號(hào)’為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)田土壤為黃棕壤，土壤基本理化性質(zhì)：pH 7.26，有機(jī)質(zhì)13.52 g·kg-1，堿解氮75.18 mg·kg-1，速效磷9.17 mg·kg-1，速效鉀164.37 mg·kg-1，每株留葉數(shù)均為18片，田間管理措施均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行[18]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)趙銘欽等[19]對(duì)于成熟度的劃分，將煙葉分別設(shè)定為欠熟、未熟、尚熟、適熟和過(guò)熟5個(gè)成熟度，分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株進(jìn)行取樣，取樣部位為中部葉(10～12葉位)，將煙葉的主脈從葉片中剝離備用。一部分樣品在采集后立即放入干冰中速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，并轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于相關(guān)生理指標(biāo)檢測(cè)和基因表達(dá)測(cè)定，其他樣品用于NBT化學(xué)組織染色。每個(gè)時(shí)期進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1NBT組織化學(xué)染色 用吉列雙刃刀片于載玻片上取1 mm厚的煙葉主脈截面(靠近端口處)切片，將主脈切片投入盛有0.1% NBT的離心管中，染色48 h后取出主脈切片，吸干水分，在M165 FC立體式顯微鏡(LECIA, 德國(guó))下拍照并分析染色情況[20]。

1.3.2O2-、H2O2和MDA含量的測(cè)定 分別使用超氧陰離子測(cè)試試劑盒(SA-2-G，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)、過(guò)氧化氫測(cè)試試劑盒(H2O2-2-Y，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書測(cè)定O2-和H2O2含量，使用硫代巴比妥酸法[21]測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.3衰老相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定 以未熟的‘K326’煙葉主脈作為對(duì)照，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。從GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索煙草NtCP1、NtCP2序列并設(shè)計(jì)相關(guān)引物，以煙草核糖體蛋白基因L25為內(nèi)標(biāo)基因。引物用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。使用R1200-50T RNA抽提試劑盒(索萊寶)提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，并將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒(Qiagen，Germany)在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，85 ℃反應(yīng)5 s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算采用 2-ΔΔCt法[22]。

表1 衰老相關(guān)基因引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度煙葉主脈的NBT染色結(jié)果

NBT組織化學(xué)染色結(jié)果(圖1)顯示，隨著煙葉成熟度的增加，其煙葉主脈的活性氧也會(huì)逐漸積累。在未熟煙葉中，主脈不產(chǎn)生藍(lán)色沉淀；當(dāng)煙葉達(dá)到欠熟狀態(tài)時(shí)，主脈中略有藍(lán)色沉淀產(chǎn)生；當(dāng)煙葉表現(xiàn)為尚熟和適熟階段時(shí)，主脈切片中產(chǎn)生的藍(lán)色沉淀明顯增多；而當(dāng)煙葉過(guò)熟時(shí)，藍(lán)色沉淀幾乎覆蓋了整個(gè)主脈切片，表明活性氧在過(guò)熟葉片的主脈中大量積累，且‘K326’和‘豫煙6號(hào)’兩個(gè)品種烤煙主脈染色的變化趨勢(shì)一致，二者間基本沒有差異?？梢姡瑹熑~的成熟過(guò)程也是活性氧物質(zhì)積累的過(guò)程。

圖1 不同成熟度煙葉主脈的NBT染色

2.2 成熟過(guò)程煙葉主脈的活性氧物質(zhì)累積

由圖2可知，在煙葉成熟過(guò)程中，‘豫煙6號(hào)’主脈中的O2-含量一直高于‘K326’。在煙葉未熟時(shí)，‘K326’和‘豫煙6號(hào)’的O2-含量之間沒有顯著差異，隨著成熟度的增加，兩者之間的差別開始增大，在欠熟、尚熟和適熟時(shí)，兩個(gè)品種之間差異顯著。隨著成熟度的增加，兩個(gè)品種煙葉主脈中O2-的增加速率均表現(xiàn)出慢-快-慢-快的變化趨勢(shì)。H2O2和MDA含量的變化與O2-含量的變化趨勢(shì)基本一致，隨著煙葉成熟度的增加也均逐漸增加。相對(duì)于未熟時(shí)期，當(dāng)煙葉達(dá)到過(guò)熟程度時(shí)，‘K326’中的O2-、H2O2和MDA含量分別增加了2.81、2.02、3.59倍；‘豫煙6號(hào)’的O2-、H2O2和MDA含量分別增加了2.40、1.85和3.67倍。

注:*表示兩個(gè)品種間差異在P<0.05或P<0.01水平具有顯著性。

2.3 成熟過(guò)程中煙葉主脈衰老相關(guān)基因的表達(dá)

為了從分子水平上探索煙草主脈的衰老機(jī)理，本研究對(duì)衰老相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，在煙葉的成熟過(guò)程中，‘K326’和‘豫煙6號(hào)’煙葉主脈的NtCP1基因表達(dá)均呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且在煙葉過(guò)熟時(shí)期基因表達(dá)量最高。兩個(gè)品種的NtCP2基因的表達(dá)趨勢(shì)也一致，但NtCP2的表達(dá)趨勢(shì)與NtCP1有很大差異，成熟過(guò)程中，其表達(dá)量逐漸增加，在尚熟時(shí)達(dá)到最大值，然后其表達(dá)量又逐漸降低，直至在過(guò)熟時(shí)該基因的表達(dá)量低于未熟時(shí)期。在‘K326’和‘豫煙6號(hào)’兩個(gè)品種之間，僅在尚熟和適熟時(shí)期NtCP1的基因表達(dá)量存在顯著差異，其他時(shí)期兩個(gè)基因的表達(dá)在品種間均沒有顯著差異。

2.4 煙葉成熟過(guò)程中活性氧與衰老相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性

對(duì)烤煙主脈中活性氧含量和衰老相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在‘K326’的主脈中，MDA、H2O2和O2-三者存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。MDA、H2O2、O2-與NtCP1之間均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，與NtCP2呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性并不顯著?！?號(hào)’主脈中相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)規(guī)律與‘K326’一致，這說(shuō)明NtCP1基因與煙草衰老的關(guān)系更為緊密。

表2 活性氧、MDA含量及衰老相關(guān)基因的相關(guān)分析

3 討論

NBT染色法可以直觀、簡(jiǎn)便、快捷地檢測(cè)葉片中活性氧的產(chǎn)生情況，是在生命科學(xué)研究中經(jīng)常采用的檢測(cè)方法[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度的增加，不同成熟度主脈的NBT染色斑的面積逐步增大，表明煙葉的成熟和衰老會(huì)導(dǎo)致其主脈中活性氧物質(zhì)的積累。O2-、H2O2是主要的活性氧自由基，可以破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能，使細(xì)胞膜透性增加[23]，而MDA是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其積累會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的傷害[24]，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著煙葉成熟度的增加，主脈細(xì)胞中活性氧物質(zhì)(H2O2、O2-)逐漸積累，MDA含量增加，表明伴隨著煙葉的生長(zhǎng)發(fā)育，主脈也隨之衰老，主脈細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化程度逐漸增加，細(xì)胞膜由完整變得破裂，造成細(xì)胞衰老、死亡。

煙草中NtCP1和NtCP2皆為高度衰老特異表達(dá)基因，在細(xì)胞的程序性死亡中扮演著非常重要的角色[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉脈中NtCP1表達(dá)量在煙草成熟過(guò)程中呈逐漸上升的趨勢(shì)，基因表達(dá)規(guī)律與Beyene等[25]的研究結(jié)果一致，且與活性氧物質(zhì)和MDA含量的變化趨勢(shì)相吻合，這表明NtCP1基因在煙草細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程中扮演著非常重要的角色；NtCP2的表達(dá)則呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，與活性氧物質(zhì)和MDA含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系但相關(guān)性并不顯著。這可能與NtCP2在成熟的煙草葉片中表達(dá)較為明顯，但在衰老葉片中表達(dá)量反而下降，即基因的表達(dá)規(guī)律與煙葉的成熟規(guī)律并不一致，且與NtCP2的表達(dá)容易受到外界環(huán)境影響有關(guān)[13，18]。

在煙葉的成熟過(guò)程中，‘K326’和‘豫煙6號(hào)’主脈中的活性氧物質(zhì)、MDA含量及基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致，并且整體上 ‘豫煙6號(hào)’主脈中的活性氧物質(zhì)、MDA含量及基因表達(dá)量均高于‘K326’，這可能與烤煙品種自身遺傳因素有關(guān)。綜上所述，本研究以煙葉的主脈為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)伴隨著煙葉的成熟與衰老，煙草主脈中也會(huì)逐漸積累活性氧物質(zhì)和MDA，某些衰老相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。該研究結(jié)果為實(shí)際生產(chǎn)中利用主脈來(lái)進(jìn)行煙葉成熟度的判定提供了更多的理論支持，為煙葉的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供了指導(dǎo)。