谷冬華,郭 寧,劉 瑾,趙曉丹,李 昂,茍建重

(陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點實驗室,西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙周黏膜病科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:liujin8511@163.com)

牙周炎是由菌斑微生物引起的一種慢性感染性疾病,主要表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齒松動脫落。人牙周膜細(xì)胞(HPDLCs)作為牙周再生的主要細(xì)胞[1],在牙周炎病損部位其數(shù)量和功能會受到一定的限制。菌斑微生物中革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分為脂多糖(LPS),當(dāng)細(xì)菌死亡時它會通過溶解、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并刺激其產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子[2],而這些炎性細(xì)胞因子又會進(jìn)一步破壞牙周組織,促進(jìn)結(jié)締組織和骨組織吸收,加重牙周炎癥狀態(tài)。因此牙周炎的治療需要在控制炎癥的基礎(chǔ)上,同時達(dá)到有效抑制細(xì)菌、調(diào)節(jié)宿主防御能力的功效。目前,中藥制劑局部應(yīng)用已成為藥物治療牙周炎的研究熱點之一,而提取中藥有效部位和有效成分并進(jìn)行配伍的復(fù)方研究是中藥制劑的發(fā)展趨勢[3]。研究表明中藥黃芩的有效提取成分黃芩素具有抗菌、抗炎、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等功效[4];大黃的有效成分大黃素具有瀉火、抗菌、消炎和成骨等功效[5];黃連的有效成分鹽酸小檗堿,具有抗微生物、抗腫瘤、降血糖以及在心腦血管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)方面的作用[6],因此大黃、黃芩、黃連在牙周病的防治方面有很大的研究價值[7-9],但這3種中藥有效成分如何配伍才能起到增效減毒的作用尚無研究。前列腺素E2(PGE2)是人體免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的炎性因子,可介導(dǎo)牙周結(jié)締組織和骨組織的破壞。在牙周炎病理過程中,炎性牙齦和齦溝液中的PGE2顯著增加,同時PGE2也可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[10]。因此通過檢測出人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的含量能有效反映出牙周的炎癥情況。本研究是將3種中藥有效部位配伍復(fù)方聯(lián)合作用于LPS刺激之下的人牙周膜細(xì)胞中,通過檢測細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的濃度,篩選出具有增效減毒效應(yīng)的配伍復(fù)方,為中藥治療牙周炎提供進(jìn)一步實驗依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

LC-2010高效液相色譜儀(日本島津),ESJ120-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司),SB-5200型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司),KDC-16H高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司),TL-40B低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),78HW-1恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠),Costa 96孔培養(yǎng)板(U.S.A),SHH.W21-600B三用電熱恒溫水箱(北京長風(fēng)儀器儀表公司),滅菌手術(shù)器械(手術(shù)刀、眼科剪和眼科鑷等),滅菌培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿,吸管,移液管,離心管等。以上器械均由西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 材料

中藥黃芩、大黃、黃連(購自老百姓大藥房,經(jīng)過西安醫(yī)科大學(xué)藥房鑒定),黃芩素對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:11595-200905),大黃素對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:110756-200110),鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號:110713-200208),色譜甲醇(Honeywell Burdick&Jackson,USA),脂多糖(LPS,Sigma),PGE2ELISA kit(R&D)。

2 實驗方法

2.1 黃芩、大黃、黃連有效部位的提取與有效成分濃度測定

采用有機(jī)溶劑超聲萃取的方法提取黃芩乙醚部位、大黃乙醚部位和黃連水部位,并使用高效液相色譜法(HPLC)測定其中的黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿的含量。

2.1.1 黃芩、大黃、黃連有效部位的提取 使用電子天平分別精確稱取50 g黃連藥物放入1 000 ml燒杯中,加入200 ml甲醇水溶液(甲醇的體積分?jǐn)?shù)為70%),混合后,保鮮膜封口,超聲30 min,手機(jī)上清液,重復(fù)3次。將收集得到的上清液1 000 r/min離心,棄去底部沉淀,過濾,測量濾液體積。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將大部分液體揮去,使用甲醇的萃取物成浸膏后,移入10 ml離心管內(nèi)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸干,得黃連萃取物。加入雙蒸水(按照20 ml濾液中加入10 ml雙蒸水比例),使粗提物充分溶解后,加入與雙蒸水等體積的石油醚,混勻,超聲30 min,棄上清液,重復(fù)3次。將此剩余物加入與雙蒸水等體積的乙醚混勻,超聲30 min,棄上清液,重復(fù)3次。再將剩余物中加入與雙蒸水等體積的氯仿,混勻,超聲30 min,棄去下層液體,重復(fù)3次,剩余物即為黃連水部位,旋轉(zhuǎn)蒸干,置陰涼處干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

黃芩、大黃乙醚部位提取方法,同黃連水部位加入石油醚前的操作步驟,再將石油醚萃取后的剩余物中,加入與石油醚等體積的乙醚,超聲萃取30 min,收集上清液,揮干,即得到黃芩和大黃乙醚部位,置陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 黃芩、大黃、黃連有效成分濃度測定 色譜條件:色譜柱Chromolith C18(50 mm×4.6 mm,20 μm,Merck)。流動相:黃芩素為甲醇(A)-0.4%冰醋酸+0.2%三乙胺(B)(V∶V=50 ∶50);大黃素為甲醇(A)-0.1%冰醋酸(B)(V∶V=80 ∶20);鹽酸小檗堿為乙腈(A)-水(B)(V∶V=28 ∶72)。梯度洗脫條件為0-2 min,20%A;2-10 min,20%-65%A;10-12 min,65%A;12-14 min,65%-20%A。檢測波長為黃芩素254 nm,大黃素254 nm,鹽酸小檗堿360 nm。柱溫為28-30 ℃。體積流量為0.2 ml/min。進(jìn)樣體積為5 μl。

有效濃度測定:稱取各對照品1 mg,色譜甲醇溶解并定容至5 ml,得對照品原液,采用梯度稀釋法獲得 100,80,60,40,20 μg/ml系列濃度的對照品儲備液。精確稱取各樣品1 mg,色譜甲醇溶解并定容至5 ml,高效液相色譜法測定其中的黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿的含量。

2.2 中藥有效部位對LPS刺激人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響

2.2.1 HPDLCS的培養(yǎng)和鑒定 選取西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科門診年齡為12-20歲青少年因正畸治療拔除的健康前磨牙及第三磨牙。牙齒拔除后直接置于無菌D-Hanks液中反復(fù)沖洗操作后轉(zhuǎn)移到盛有DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,刮取根中1/3處的牙周膜組織,剪碎(約1 mm×1 mm×1 mm)培養(yǎng)和傳代,選取3-5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),事先告知患者并簽署知情同意書。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA法)測定黃芩、大黃、鹽酸小柴堿對LPS刺激HPDLCs產(chǎn)生PGE2的影響 取對數(shù)生長期的第6代人牙周膜細(xì)胞,用0.25%胰酶消化后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液,按照4×104個細(xì)胞/ml的密度,每孔接種200 μl接種于96孔板,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。在細(xì)胞鋪滿80%時,吸去上清液分別加入32組藥物+1 μg/ml LPS 200 μl,同時設(shè)空白對照組(只加入DMEM培養(yǎng)基)和LPS組(只加入1 μg/ml LPS),每組設(shè)3個復(fù)孔,37 ℃下培養(yǎng)72 h。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA法)測定大黃、黃芩、黃連有效部位對HPDLCs產(chǎn)生PGE2含量的影響。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 黃芩、大黃、黃連有效成分濃度測定

3.1.1 大黃乙醚部位中大黃素含量的測定 按照色譜條件測得大黃素的保留時間為7.9 min,得出大黃素對照品濃度分別為60,40,20,10,1 μg/ml時的色譜圖及大黃素乙醚部位色譜圖(見圖1A),并根據(jù)各濃度時的大黃素保留峰面積,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=62 008x-49 745,R2=0.995 4,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線通過濃度換算,得出大黃素在大黃乙醚部位中含量為7.50%。

3.1.2 黃芩乙醚部位中黃芩素含量的測定 按照色譜條件測得黃芩素的保留時間為14 min,得出黃芩素對照品濃度分別為100,80,60,40,20 μg/ml時的色譜圖及黃芩乙醚部位色譜圖(見圖1B),并根據(jù)各濃度時的黃芩素保留峰面積,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=130 253x-106,R2=0.993 0,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線通過濃度換算,得出黃芩素在黃芩乙醚部位中含量為19.94%。

3.1.3 黃連水部位中鹽酸小檗堿含量的測定 按照色譜條件測得鹽酸小檗堿的保留時間為7.9 min,得出鹽酸小檗堿對照品濃度分別為100,80,60,40,20 μg/ml時的色譜圖及黃連水部位的色譜圖(見圖1C),并根據(jù)各濃度時的鹽酸小檗堿保留峰面積,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=8 486.1x-9 099.6,R2=0.998 5,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線通過濃度換算,得出鹽酸小檗堿在黃連水部位中含量為80.87%。

圖1 大黃、黃芩、黃連水活性部位通過HPLC的色譜圖

3.2 HPDLCs原代培養(yǎng)及鑒定

HPDLCs細(xì)胞爬片經(jīng)HE染色后,在光鏡下觀察可見細(xì)胞呈長梭形或呈多角形,數(shù)個突起,胞漿紅染,單核,胞核呈藍(lán)紫色,圓形或橢圓形,居中,2-3個核仁,細(xì)胞排列呈柵欄狀、旋渦狀、放射狀(見圖2A)。細(xì)胞爬片經(jīng)免疫組化染色后,在光鏡下觀察,波形蛋白染色后,細(xì)胞胞漿呈棕黃色著色(見圖2B),角蛋白染色細(xì)胞漿無著色(見圖2C)。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是外胚層間充質(zhì)來源,而非上皮來源。綜上所述,所培養(yǎng)細(xì)胞為人牙周膜細(xì)胞。

圖2 PDLCs細(xì)胞HE染色和免疫組化染色(×200)

3.3 黃芩、大黃、黃連有效部位配伍對LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響

經(jīng)過前期實驗[11,12],得出黃芩素,大黃素,鹽酸小檗堿對人牙周膜細(xì)胞增殖活性的影響,得出最有效濃度分別為1.0,0.1,0.1 mg/L。根據(jù)測得的大黃乙醚部位,黃芩乙醚部位和黃連水部位中黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿含量分別為19.94%,7.5%,80.87%,得到以黃芩素含量計量黃芩乙醚部位的濃度為5 mg/L,以大黃素含量計量大黃乙醚部位的濃度為1.3 mg/L,以鹽酸小檗堿含量計量黃連水部位的濃度為0.12 mg/L,將此濃度分別按照×10倍和×0.1倍,再加上0 mg/L,組成每種藥物有效部位的4個濃度,借鑒L32(4)9正交表進(jìn)行實驗分組。

將表1中每種中藥的4個不同濃度分別與其他兩種中藥的不同濃度相配伍,得出32組不同濃度配伍組并加入1 μg/ml的LPS 200 ml,與空白組(DEME培養(yǎng)基組)、LPS組對照得出人牙周膜細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的濃度,結(jié)果見表2。

表1 大黃、黃芩、黃連有效部位配伍不同濃度 (mg/L)

表2 大黃、黃芩、黃連有效部位配伍組對LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響

為進(jìn)一步控制選擇偏倚,將表2中32個實驗組平均分成4組。1-8為組1,9-16為組2,17-24為組3,25-32為組4。采用t檢驗,組1、組2、組3、組4的PGE2濃度均高于空白對照組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3)。組1、組2、組3、組4的PGE2濃度均低于只加LPS刺激組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3)。這說明每組中至少有1組實驗的藥物配伍能夠有效減少LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的含量,隨后選取每組PGE2減少比例最高的樣本為進(jìn)一步尋找有效配伍提供依據(jù)。從表2的32個實驗組中篩選出的有效濃度的5個配伍組,結(jié)果見表4,為后續(xù)體內(nèi)動物實驗提供體外實驗依據(jù)。

表3 四組藥物配伍與兩種對照組PGE2的比較

表4 五個對人牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2效果明顯的配伍組

4 討論

本實驗所選用的3種中藥,即黃芩、大黃、黃連,三者具有相似的理化特性及抗菌、抗炎作用,并均被證實且廣泛應(yīng)用于臨床治療?；诖?如何提取這3種中藥的有效部位并進(jìn)行復(fù)方配伍,測定其中的有效濃度,是將其運用于臨床治療的重要前提。中藥有效部位源自中藥或復(fù)方中藥提取物,它是其中某些含量達(dá)到總提取物的50%以上的化學(xué)成分混合體。以此種提取物制成的中藥新藥即為有效部位新藥。此外,尚有活性較強(qiáng)的活性成分在有效部位中含量很低,但是作用卻很強(qiáng)。因此單純根據(jù)藥物的含量多來定義有效部位不是很科學(xué)的[13]。本研究使用HPLC技術(shù),采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對黃芩乙醚部位、大黃乙醚部位和黃連水部位中相應(yīng)的黃芩素、大黃素和鹽酸小檗堿進(jìn)行濃度測定,并以其作為各有效部位的質(zhì)量控制指標(biāo)。然后應(yīng)用最適濃度稀釋和濃縮原理,確定各部位的4個濃度,進(jìn)而配伍組成32組,這樣進(jìn)一步將有效濃度進(jìn)行細(xì)化分組,為細(xì)胞實驗提供基礎(chǔ)藥物環(huán)境。

前列腺素E2(PGE2)作為一種重要的細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)因子,具有廣泛的致炎效應(yīng),如誘導(dǎo)血管擴(kuò)張、增加毛細(xì)血管通透性,并與其他的炎癥介質(zhì)(IL-1,TNF-α)有協(xié)同作用。PGE2介導(dǎo)骨吸收的最初證據(jù)是Klein等[14]1970年報道的。在牙周膜中產(chǎn)生PGE2的主要細(xì)胞是牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞。并且有研究已證實牙周炎的骨破壞與高水平的PGE2密切相關(guān)[15]。通過本次實驗初步研究,在確定3種中藥各自有效濃度后,我們發(fā)現(xiàn)有5組配伍即5 mg/L黃芩乙醚部位和0.12 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.01 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.50 mg/L黃芩乙醚部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和5 mg/L黃岑乙醚部位配伍,單一藥物50mg/L黃岑乙醚部位。這5組配伍可明顯檢測出有效減少的因LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞中PGE2的濃度,并且對抑制PGE2的炎性具有明顯表達(dá),減輕因炎癥刺激而產(chǎn)生的牙齦組織充血和骨組織吸收等不良反應(yīng)有積極作用。實驗結(jié)果均為黃芩、大黃、黃連3味中藥中2味藥或者單味藥的效果較好,因為這3種中藥的藥物濃度設(shè)置是在前期藥物活性篩選并且各自促進(jìn)細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上確定的,但是并不能說明單味藥物的最適濃度就是復(fù)方配伍藥物的最適宜濃度,后續(xù)實驗我們會根據(jù)結(jié)果進(jìn)行更多濃度的篩選。本次實驗結(jié)果中顯示,單一藥物黃芩在濃度為50 mg/L的黃芩乙醚表現(xiàn)出有效減少因LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞中PGE2的濃度明顯,PGE2的減少比例為45.66%,而在其他濃度中未見明顯的濃度變化,這表明單一藥物在不同濃度下的藥效特性。黃芩素是黃芩的最主要的活性成分之一,它通常被用作黃芩及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。黃芩素可通過抑制淋巴細(xì)胞的功能和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[16]。黃芩素鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制主要是調(diào)節(jié)炎性疼痛潛在的靶點脂氧合酶[17]。黃芩素也可通過減少來自與巨噬細(xì)胞的一氧化氮(nitric oxide,NO),對促炎癥基因的表達(dá)進(jìn)行,從而抑制LPS刺激下,巨噬細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)型一氧化碳合酶mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá),而這種抑制作用具有劑量依賴性[18]。與本次實驗結(jié)果相符合。

另外,在此次實驗中復(fù)方配伍對中13 mg/L大黃乙醚部位和5 mg/L黃芩乙醚部位配伍這一組配伍在有效減少的因LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞中PGE2的濃度中效果最好,PGE2的減少比例為51.45%,明顯優(yōu)于其他3組配伍對。分析其成分發(fā)現(xiàn),中藥大黃的主要有效單體為大黃素(emodin)主要來源于蓼科植物的干燥根莖和根,是一種蒽醌類衍生物。劉冰等[19]通過研究大黃素對實驗性牙周炎模型牙齦組織及外周血中的NO含量的變化,得出大黃素可以通過降低牙周炎大鼠牙齦及外周血中NO的含量,而對牙周炎有一定的治療作用。而本次實驗中可發(fā)現(xiàn)有效配伍對中含有大黃乙醚的共計3組,且濃度均為13 mg/L,這也進(jìn)一步提示此濃度可能是大黃乙醚中大黃素發(fā)揮藥效的有效濃度。

在這5組有效藥物濃度的配伍組中,4組復(fù)方配伍對和1組單一配伍相比較下,單一配伍組在有效減少的因LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞中PGE2的濃度中效果略優(yōu)于5 mg/L黃芩乙醚部位和0.12 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.012 mg/L黃連水部位配伍,13 mg/L大黃乙醚部位和0.50 mg/L黃芩乙醚部位配伍,而較差于13 mg/L大黃乙醚部位和5 mg/L黃芩乙醚部位配伍這一組效果。這樣的結(jié)果并不能完全說明復(fù)方配伍對的效果優(yōu)于單一配伍對,針對每種中藥還需進(jìn)一步證實其核心成分的細(xì)胞學(xué)及藥理學(xué)實驗結(jié)果。

綜上所述,是通過體外細(xì)胞實驗,將3種藥效相似的中藥黃芩、大黃、黃連進(jìn)行有效部位的配伍組合,選擇采用體外分離人牙周膜細(xì)胞作為實驗對象,測定加入LPS刺激下PGE2的濃度,進(jìn)一步篩選出來有效濃度配伍復(fù)方。并且,采用體外細(xì)胞實驗可以有效并精準(zhǔn)地控制炎癥的水平,排除因炎癥部位人牙周膜細(xì)胞已出現(xiàn)受損,無法準(zhǔn)確檢測出受損情況初期及末期PGE2濃度變化的偏倚,測定已知炎癥水平下PGE2的濃度,這一步對于日后牙周炎初期患者臨床用具體藥具有十分重要的指導(dǎo)意義。