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      多噬香鞘氨醇單胞菌降解陜西神府褐煤的工藝條件及產(chǎn)物研究*

      2021-03-16 10:27:38劉向榮徐云龍
      煤炭轉(zhuǎn)化 2021年2期
      關鍵詞:神府原煤煤樣

      楊 杰 劉向榮,2 徐云龍

      (1.西安科技大學化學與化工學院,710054 西安;2.自然資源部煤炭勘察與綜合利用重點實驗室,710021 西安)

      0 引 言

      煤的微生物降解是指煤在微生物作用下,大分子結(jié)構(gòu)降解成小分子的過程。整個降解過程條件溫和,設備簡單,無污染,是煤炭潔凈利用的有效途徑之一[1-4]。降解產(chǎn)生的液相產(chǎn)物,包含小相對分子質(zhì)量的脂肪族和芳香族化合物等,可進一步加工提取腐殖質(zhì)材料、土壤調(diào)節(jié)劑、化學原料和液體燃料等[5]。20世紀80年代開始,國內(nèi)外學者就對煤的微生物降解進行了廣泛的研究。BASARGAN et al[6]研究了6種真菌對厄爾比斯坦褐煤和巴札利褐煤的降解效果,發(fā)現(xiàn)云芝是降解厄爾比斯坦褐煤的優(yōu)勢菌,研究表明菌種與煤種具有匹配性。HAIDER et al[7]對真菌MW1降解塔爾褐煤進行了研究,發(fā)現(xiàn)煤漿濃度、降解時間和葡萄糖含量對降解率的影響較大。徐敬堯等[8]研究了球紅假單胞菌降解義馬褐煤的工藝條件,各因素對降解率的影響由大到小依次為:煤樣粒度、煤漿濃度、降解時間、菌液用量。李俊旺等[9-10]利用多種方法對褐煤進行了預處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),硝酸預處理的效果最好,硝酸可以破壞褐煤的部分芳環(huán)結(jié)構(gòu),并對褐煤表面的官能團進行氧化,提高了含氧量,增加了微生物與煤表面的親和性,促進了褐煤的微生物降解。由此可見,影響煤微生物降解率的主要因素為煤本身的性質(zhì),而各地的煤種差別較大,因此,微生物降解煤過程中,對煤的預處理、煤樣粒度和菌煤比例等工藝條件的探討很必要。

      本實驗利用多噬香鞘氨醇單胞菌對陜西神府褐煤進行降解實驗,通過單因素和正交實驗確定了多噬香鞘氨醇單胞菌降解陜西神府褐煤的最佳工藝條件。對降解的固相產(chǎn)物和液相產(chǎn)物的組成進行分析,研究了降解前后煤結(jié)構(gòu)的變化,為進一步研究煤的微生物降解機理提供參考。

      1 實驗部分

      1.1 煤樣的制備

      實驗煤樣采自陜西神府,經(jīng)過破碎、粉磨、篩分,制得粒徑分別為:小于0.074 mm,0.074 mm~0.125 mm,0.125 mm~0.250 mm,0.250 mm~0.500 mm和大于0.500 mm五種粒度原煤煤樣。為提高降解率,不同粒徑的原煤分別經(jīng)過4 mol/L,6 mol/L,8 mol/L和10 mol/L的硝酸氧化48 h后(煤與硝酸的質(zhì)量比為1∶2.5),用蒸餾水洗滌至中性,烘干得到氧化煤樣備用。粒徑為0.074 mm~0.125 mm的原煤和8 mol/L的硝酸氧化煤及降解后的固相產(chǎn)物(剩煤)的工業(yè)分析和元素分析見表1。由表1可以看出,原煤經(jīng)硝酸氧化后,灰分減少,碳元素、氫元素和硫元素質(zhì)量分數(shù)降低,氧元素質(zhì)量分數(shù)由23.96%增加到36.15%,氮元素質(zhì)量分數(shù)由2.68%增加到5.08%;氧化煤經(jīng)細菌作用后,碳元素、氧元素和氫元素質(zhì)量分數(shù)有不同程度的降低,這表明煤中部分化學鍵斷裂,小分子物質(zhì)溶解到了液相產(chǎn)物中。

      表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析

      1.2 菌種的活化

      實驗所用的多噬香鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspolyaromaticivorans)購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC),編號為CICC 10894,可降解2環(huán)~4環(huán)的環(huán)芳香烴和菲。采用打管活化法對細菌進行活化。首先用75%的酒精棉將凍干管表面進行消毒處理,用鑷子夾住管的中間位置,將管頂端在酒精燈外焰上加熱45 s,立刻滴2滴~3滴無菌水于加熱部位,使其破裂。隨后用鑷子輕敲使其破裂,用滅菌的吸管吸取0.5 mL無菌水溶解菌。然后,將接種環(huán)在酒精燈上高溫滅菌后浸入到菌液中在固體培養(yǎng)基上劃線,得到的斜面靜置培養(yǎng)。最后,取斜面活化的菌種接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中,在30 ℃,160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng),菌種經(jīng)過3代活化培養(yǎng)后,用于煤降解實驗[11]。

      1.3 培養(yǎng)基的配制

      實驗所用的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,具體組成為:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,pH值為7.0。將配制好的培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋120 ℃,0.1 MPa滅菌15 min備用。

      1.4 煤微生物降解率的計算

      煤微生物降解實驗結(jié)束后,通過離心分離液相產(chǎn)物和固相產(chǎn)物(剩煤),固相產(chǎn)物(剩煤)經(jīng)過洗滌、干燥用于計算降解率。通常利用式(1)計算降解率η[12]。

      η=(m0-m)/m0×100%

      (1)

      式中:m0為原煤/氧化煤樣的初始質(zhì)量,g;m為降解實驗結(jié)束后固相產(chǎn)物(剩煤)的質(zhì)量,g。

      1.5 單因素實驗

      將(0.500 0±0.000 5)g的神府氧化煤樣置于150 mL的錐形瓶中,加入50 mL培養(yǎng)基,然后高壓滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻到常溫時,再加入5 mL細菌菌液,隨后將錐形瓶放入160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間。相同的培養(yǎng)條件下,分別改變降解時間(1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d,7 d,8 d,9 d,10 d,11 d,12 d,13 d,14 d,15 d)、硝酸濃度(0 mol/L,4 mol/L,6 mol/L,8 mol/L,10 mol/L)、培養(yǎng)溫度(25 ℃,30 ℃,35 ℃,40 ℃)、煤樣粒度(<0.074 mm,0.074 mm~0.125 mm,0.125 mm~0.250 mm,0.250 mm~0.500 mm,>0.500 mm)和降解方式(搖床培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)),研究各因素對褐煤降解效果的影響。每組實驗設置三個平行實驗,培養(yǎng)結(jié)束后,離心分離液相產(chǎn)物和固相產(chǎn)物(剩煤),利用式(1)計算平均降解率。

      1.6 正交實驗

      在單因素實驗的基礎上,對煤樣粒度(A)、硝酸濃度(B)、菌液量(C)和降解時間(D)采用四因素三水平正交實驗。正交實驗表頭設計采用L9(34)。在本正交實驗中不考慮各因素之間的交互影響。正交實驗見表2。

      表2 正交實驗因素及水平

      1.7 降解產(chǎn)物分析

      對陜西神府煤的原煤、氧化煤和微生物作用后的固相產(chǎn)物(剩煤)進行掃描電鏡分析。煤樣噴金60 s,電壓為5 kV,放大倍數(shù)為10 000倍。利用Thermo Scientific型傅立葉變換紅外光譜儀(美國,賽默飛世爾科技有限公司),采用定量KBr壓片法,在4 000 cm-1~400 cm-1波長范圍內(nèi),對原煤、氧化煤、固相產(chǎn)物(剩煤)、液相產(chǎn)物進行紅外光譜掃描。煤的微生物降解實驗結(jié)束后,將液相產(chǎn)物收集起來,通過直徑為0.22 μm的除菌過濾器除掉殘留菌絲體,以培養(yǎng)的菌液為參比進行實驗,利用TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)檢測其在波長200 nm~650 nm范圍內(nèi)的吸光度以推測液相產(chǎn)物的組成。將除菌過濾器過濾后的液相產(chǎn)物依次用石油醚、正己烷、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇分級萃取,旋蒸萃取產(chǎn)物除去水分,然后將處理好的產(chǎn)物分別用各對應的有機物稀釋后,利用安捷倫7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國,安捷倫科技公司)進行分析,流動相為甲醇,氣氛為氦氣。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 單因素實驗結(jié)果

      2.1.1 降解時間對降解率的影響

      多噬香鞘氨醇單胞菌對神府褐煤的降解率隨時間的變化如圖1所示。由圖1可以看出,第0天~第1天是菌種的快速繁殖時期,從第1天開始到第5天,多噬香鞘氨醇單胞菌對神府煤的降解率隨著菌種的大量的繁殖而快速上升。在第5天~第8天,降解率保持平穩(wěn),略有下降,推測這是由于菌種將前期從煤中釋放的部分有機物吸收用于自身生長。由于菌種的活性增強,在第8天~第9天降解率又出現(xiàn)了快速增長,在第9天~第12天出現(xiàn)緩慢上升的趨勢,在第12天~第13天增長更為迅速。而在第13天~第15天降解率基本不變,降解率約為65%。因此,最佳的降解時間為13 d。

      圖1 降解時間對降解率的影響

      2.1.2 硝酸濃度對降解率的影響

      多噬香鞘氨醇單胞菌對不同濃度硝酸預處理煤樣降解率的影響如圖2所示。由圖2可以看出,隨著硝酸濃度的增大,煤樣氧化程度增加,其降解率也逐漸增大。多噬香鞘氨醇單胞菌對原煤的降解率僅為12.25%,而對10 mol/L硝酸氧化煤的降解率最高,達到75.86%。由此可見,煤樣氧化程度是影響微生物降解煤效果的重要因素之一。硝酸濃度越高,其氧化性越強,對煤樣的破壞程度越大,同時除去了煤中的一些礦物質(zhì),提高了煤的純度,煤結(jié)構(gòu)更為疏松,使得降解率大幅度提高。

      圖2 硝酸濃度對降解率的影響

      2.1.3 培養(yǎng)溫度對降解率的影響

      多噬香鞘氨醇單胞菌在不同溫度下對神府煤的降解率如圖3所示。由圖3可以看出,降解率隨著溫度升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,多噬香鞘氨醇單胞菌在35 ℃時對神府煤的降解率最高(66.28%)。由此可見,多噬香鞘氨醇單胞菌在25 ℃條件下生長較為緩慢,菌種活性低,分泌物量小,使得降解效果不佳。當溫度升至30 ℃,降解率明顯增加。而在35 ℃時,多噬香鞘氨醇單胞菌處于最適生長溫度,在其最適生長溫度下,細菌快速生長繁殖,產(chǎn)生大量分泌物,促進了煤的微生物降解,降解率達到最大值。溫度升至40 ℃時,較高的溫度導致蛋白質(zhì)變性,細菌分泌物活性降低,降解率減小。

      圖3 培養(yǎng)溫度對降解率的影響

      2.1.4 煤樣粒度對降解率的影響

      多噬香鞘氨醇單胞菌對不同粒徑神府煤的降解率如圖4所示。由圖4可以看出,隨著煤樣粒度增大,降解率逐漸減小。當煤粒徑為小于0.074 mm時,多噬香鞘氨醇單胞菌對神府煤的降解率為75.05%。當煤樣粒度大于0.500 mm時降解率僅為49.02%。煤樣粒徑越小,煤的微生物降解效果越好,這是因為在相同的條件下,粒徑越小,煤樣的比表面積越大,更有利于煤樣與微生物的分泌物相互接觸,從而提升了降解效果[13]。

      圖4 煤樣粒度對降解率的影響

      2.1.5 降解方式對降解率的影響

      多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府煤在搖床培養(yǎng)與靜置培養(yǎng)方式下的降解率分別為65.91%和45.25%,搖床培養(yǎng)條件下的降解率明顯高于靜置培養(yǎng)條件下的降解率。多噬香鞘氨醇單胞菌為好氧細菌,搖床培養(yǎng)能夠增加培養(yǎng)基的溶氧率,提高細菌活性,促進煤的微生物降解,并且搖床培養(yǎng)也能夠使煤樣與微生物充分接觸[14-15]。因此,搖床培養(yǎng)降解率高于靜置培養(yǎng)降解率。

      2.2 正交實驗結(jié)果

      多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府煤的正交實驗結(jié)果見表3。由表3可知,極差R的計算表明最佳工藝條件為A3B3C3D1,即0.074 mm~0.125 mm的煤樣粒度、10 mol/L硝酸氧化煤樣、8 mL菌液量、14天降解時間、35 ℃的培養(yǎng)溫度以及搖床培養(yǎng)方式,此時最大降解率為78.59%。各因素對降解率影響由大到小順序依次為:B,D,C,A。

      表3 多噬香鞘氨醇單胞菌對神府煤的降解率實驗結(jié)果分析

      多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府煤的實驗結(jié)果方差分析如表4所示。查F分布表,F(xiàn)0.05(2,2)=19.0,

      表4 多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府煤的正交實驗數(shù)據(jù)方差分析

      F0.01(2,2)=99.0,F(xiàn)0.1(2,2)=9.0。由表4可知,在給定可信度90%的情況下,硝酸濃度對煤的微生物降解有非常顯著的影響,與極差分析的結(jié)果一致。

      2.3 掃描電鏡分析

      對神府煤的原煤、氧化煤和微生物作用后的固相產(chǎn)物(剩煤)進行掃描電鏡分析,結(jié)果見圖5。由圖5可以看出,硝酸氧化和多噬香鞘氨醇單胞菌的作用均能改變神府煤的表面形態(tài)。神府煤未處理時呈塊狀、粒狀或片狀;經(jīng)硝酸處理后,片狀結(jié)構(gòu)增多,煤樣表面變得更加光滑和松散;經(jīng)微生物處理后,煤樣表面出現(xiàn)較多的溝壑,表明微生物能夠有效地降解煤。

      圖5 煤樣的掃描電鏡照片

      2.4 N2吸附分析

      對原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)進行低溫氮氣吸附-脫附。通過BET比表面積法和Langmuir比表面積法,計算的各煤樣的比表面積如表5所示。由表5可知,通過BET法計算得到的結(jié)果顯示神府煤經(jīng)硝酸氧化后比表面積由1.191 3 cm2/g增加到5.603 1 cm2/g,是原煤的4.7倍。通過Langmuir法計算原煤經(jīng)硝酸氧化后表面積增加了4.8倍。煤經(jīng)多噬香鞘氨醇單胞菌作用后得到的固相產(chǎn)物(剩煤)的比表面積明顯下降,這說明微生物作用能夠降解煤的部分組成,使煤的比表面積發(fā)生變化。

      表5 神府原煤和氧化煤及固相產(chǎn)物(剩煤)的累積吸附表面積

      原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的孔容與相對壓強的關系如圖6所示。由圖6a和圖6c可以看出,原煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的吸附-脫附曲線較為接近,這說明煤中主要含有一端封閉的不透氣性孔。由圖6b可以看出,氧化煤的吸脫附曲線產(chǎn)生了明顯的滯后環(huán)且有拐點,推測其含有開放性透氣性孔,包括兩端開口圓筒形孔及四邊開口的平行板孔[16-17]。

      圖6 煤樣的N2吸附-脫附等溫線

      煤的比孔面積-孔徑分布如圖7所示。由圖7可知,神府煤的孔徑主要分布在4 nm以下,硝酸處理后孔徑明顯增加,主要分布在2 nm~100 nm,這說明硝酸處理使原煤的孔結(jié)構(gòu)變大,由中孔變?yōu)榇罂?。鞘氨醇單胞菌尺寸?500~1 000)nm×(1 000~3 000)nm[18],因此,細菌僅吸附在煤的表面,對煤產(chǎn)生降解作用。YIN et al[19]在研究微生物降解頁巖中烴類物質(zhì)時,同樣發(fā)現(xiàn)頁巖樣品的孔徑(2 nm~50 nm)小于細菌的平均直徑1 000 nm,限制了微生物進入頁巖孔隙。

      圖7 原煤和氧化煤及固相產(chǎn)物(剩煤)的比孔面積-孔徑分布

      2.5 原煤和氧化煤及固液相產(chǎn)物的紅外光譜分析

      神府原煤、氧化煤、降解后的固相產(chǎn)物(剩煤)和液相產(chǎn)物的紅外光譜見圖8。由圖8可以看出,原煤、氧化煤、液相產(chǎn)物和固相產(chǎn)物(剩煤)大部分結(jié)構(gòu)是相同的,只是在個別譜峰位置處存在差異。硝酸預處理使得神府氧化煤在1 717 cm-1,1 540 cm-1和1 335 cm-1處出現(xiàn)明顯的吸收峰,分別為羧基、硝基和羥基的特征峰[20,6],表明神府煤在一定程度上被氧化,產(chǎn)生了更多的含氧官能團,造成了元素分析中氧化煤的氮和氧含量升高。

      圖8 神府原煤和氧化煤及固相產(chǎn)物(剩煤)以及液相產(chǎn)物的紅外光譜

      氧化煤在3 618 cm-1處存在顯著的伯胺吸收峰,而固相產(chǎn)物(剩煤)并無明顯存在,表明多噬香鞘氨醇單胞菌對氧化煤的伯胺產(chǎn)生了降解作用[5]。液相產(chǎn)物和固相產(chǎn)物(剩煤)的紅外光譜在3 162 cm-1附近處均有一個明顯的羥基吸收峰。氧化煤和液相產(chǎn)物在2 915 cm-1附近處的吸收峰為環(huán)烷烴,而固相產(chǎn)物(剩煤)中并未出現(xiàn),這說明多噬香鞘氨醇單胞菌能夠?qū)h(huán)烷烴從氧化煤中釋放到液相產(chǎn)物中[21]。氧化煤在1 717 cm-1和1 613 cm-1處的吸收峰分別為羧基和羰基的特征峰,經(jīng)過細菌作用后,固相產(chǎn)物(剩煤)中該特征峰強度明顯減弱。

      液相產(chǎn)物在1 653 cm-1處出現(xiàn)強的吸收峰,說明羰基物質(zhì)被降解到了液相產(chǎn)物中,峰位置的偏移則是由于共軛效應的存在[5]。液相產(chǎn)物在1 397 cm-1為甲基的彎曲振動。在1 232 cm-1處吸收峰為酚氧結(jié)構(gòu)中的C—O伸縮與O—H彎曲,說明其含有大量的酚類物質(zhì)[22]。在1 056 cm-1處C—O—C的吸收峰表明液相產(chǎn)物中含有酯類物質(zhì)[23]。500 cm-1~1 000 cm-1處的吸收峰為芳環(huán)側(cè)鏈,說明液相產(chǎn)物中含有芳香類化合物。

      2.6 液相產(chǎn)物的紫外光譜分析

      多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府煤液相產(chǎn)物的紫外光譜如圖9所示。由圖9可知,在200 nm~650 nm的波長范圍內(nèi)有3個吸收帶,最大吸收峰分別在203 nm,236 nm 和296 nm處。在203 nm和296 nm處分別為E2帶和B帶,兩個吸收帶是由苯環(huán)上三個共軛雙鍵的π—π*躍遷引起的,表明液相產(chǎn)物含有芳香族化合物。在236 nm處的K帶則證明液相產(chǎn)物中含有不飽和酮、醛、酸或酯等[24]。液相產(chǎn)物紅外光譜中的苯環(huán)側(cè)鏈、羰基和酯類物質(zhì)的特征峰均與紫外分析的結(jié)果相對應。

      圖9 液相產(chǎn)物的紫外光譜

      2.7 GC-MS分析

      多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府煤的液相產(chǎn)物總離子流色譜見圖10。a~g的萃取劑分別為石油醚、正己烷、甲苯、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和甲醇。由圖10可以看出,每個有機溶劑的萃取都有峰出現(xiàn),這些峰對應物質(zhì)的相對分子質(zhì)量在97~418之間,說明煤的大分子結(jié)構(gòu)被降解為小分子物質(zhì)。a和b的譜峰較為相似,主要含有酯類和酰胺類物質(zhì)。甲苯萃取物主要包含芳香族化合物、烯烴、苯酚和酯類化合物。二氯甲烷萃取物中主要有含氮化合物、烯烴、醇、酯和酰胺類化合物。丙酮萃取物中主要含有惡唑、亞胺、苯酚、呋喃、酯和酰胺類化合物。乙酸乙酯萃取物主要含有酰胺類物質(zhì)。甲醇萃取物主要含有酮、烷烴、胺、酯和酰胺類化合物。因此,多噬香鞘氨醇單胞菌能夠降解神府煤產(chǎn)生烴類、酯類、酚類和酰胺類物質(zhì)。GC-MS檢測到液相產(chǎn)物存在2-甲基環(huán)己醇、1-環(huán)戊基乙酮、2,6-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二(7-甲基辛基)酯等化合物。同時,液相產(chǎn)物的紅外光譜分別在3162 cm-1,1 613 cm-1,1 232 cm-1和1 056 cm-1處出現(xiàn)羥基、羰基、酚羥基和酯基特征峰,紫外光譜在203 nm和296 nm處出現(xiàn)了芳香族化合物的吸收峰,說明GC-MS結(jié)果與紅外和紫外光譜的分析結(jié)果相一致。

      圖10 液相產(chǎn)物總離子流色譜

      3 結(jié) 論

      1)多噬香鞘氨醇單胞菌降解神府褐煤的最佳工藝條件為:煤樣預處理采用10 mol/L硝酸氧化,煤樣粒度0.074 mm~0.125 mm,菌液量8 mL/50 mL(培養(yǎng)基),降解時間14天,培養(yǎng)溫度35 ℃以及培養(yǎng)方式采用搖床培養(yǎng),此時最大降解率為78.59%。

      2)神府氧化煤經(jīng)細菌作用后,煤的表面出現(xiàn)較多的溝壑。硝酸氧化神府褐煤可以增加原煤的孔徑、比表面積和含氧官能團,如羥基和羧基,有利于微生物和煤相互作用。氧化煤經(jīng)多噬香鞘氨醇單胞菌降解后,開放性透氣性孔變?yōu)榉忾]的不透氣性孔,且孔徑和比表面積均下降。

      3)紅外光譜、紫外光譜和氣質(zhì)聯(lián)用的分析表明,多噬香鞘氨醇單胞菌降解煤中的芳環(huán)側(cè)鏈和伯胺等,產(chǎn)生烴類、酯類、酰胺類和芳香類化合物。

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