李萬軍,趙春光,方海田

(1.寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室,寧夏 銀川 750021;2.寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川 750021;3.寧夏伊品生物科技股份有限公司,寧夏 銀川 750100)

L-賴氨酸是人類和動物所必需八大氨基酸之一[1]。在醫(yī)療方面應用非常廣泛,比如防治骨質疏松癥,提高機體的免疫功能和對傳染病的抗病能力[2],又如賴谷復合鹽用于治療慢性腦組織缺血、顱腦外傷病及缺氧性疾病的腦保護[3],還可以用于治療單純皰疹病毒和帶狀皰疹引起的唇皰疹[4]等。近年來,90%以上的L-賴氨酸產品用于飼料添加劑[5],各大生產企業(yè)相繼擴能投產,行業(yè)競爭慘烈。如何提高賴氨酸發(fā)酵糖酸轉化率、降低設備腐蝕,是降低生產成本提高企業(yè)競爭力的關鍵點。甜菜堿作為發(fā)酵促進劑在氨基酸發(fā)酵中應用的研究很多,總結其主要功能包括兩點:1)維持和調節(jié)細胞滲透壓。當外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時,細胞吸收或合成的甜菜堿通過穩(wěn)定蛋白質結構、提高鉀鈉泵功能和阻止胞內水分丟失等方式增加細胞對滲透壓的抗性。黃登高等[6]在研究乳酸發(fā)酵時發(fā)現,甜菜堿能夠提高高糖濃度下乳酸菌的細胞生長速率和乳酸脫氫酶的活力,進而提高乳酸產量。2)參與甲基化反應。常立群等[7]發(fā)現在谷氨酸發(fā)酵中添加適量甜菜堿可提高谷氨酸產酸。劉麗君[8]在L-異亮氨酸產生菌的選育及發(fā)酵條件研究中介紹到,通過添加甜菜堿2.5 g/L使得蘇氨酸發(fā)酵周期縮短12 h,L-異亮氨酸產量提高66.3%。趙琳琳[9]在脫氮假單胞菌產VB12發(fā)酵過程中甜菜堿作用機理及其補料策略的研究中介紹了甜菜堿在發(fā)酵過程中作用機理,甲基參與合成甲硫氨酸、VB12和丙氨酸等多種物質,并指出甜菜堿分子中含有3個甲基,是高效的甲基供體,還得出甜菜堿質量濃度在2～3 g/L時菌濃增加了10.5%,VB12產量增加了23.8%的結論。

磷酸甜菜堿是甜菜堿的磷酸鹽,在賴氨酸發(fā)酵中應用研究較少。目前,大多數企業(yè)在賴氨酸發(fā)酵配方中添加一定量的氯化膽堿起到調節(jié)滲透壓、提供甲基化反應的甲基的作用,但氯化膽堿中氯離子對設備腐蝕性嚴重?！爸袊暳闲袠I(yè)信息網”報道,市場上質量分數為21%的氯化膽堿價格逐年上漲,2016年均價5 400元/噸,2017年漲至6 319.5元/噸,2018年漲至15 000元/噸,已經造成賴氨酸發(fā)酵成本上升10元/噸理論酸,而磷酸甜菜堿市場價格2016年為9 600元/噸、2017年8 952元/噸、2018年13 500元/噸。相比之下磷酸甜菜堿價格上漲幅度較小。因此,筆者繼續(xù)實驗了磷酸甜菜堿替代氯化膽堿在賴氨酸發(fā)酵中的應用,可為提高賴氨酸發(fā)酵指標、降低生產成本提供方向。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

伊品生物科技股份有限公司菌種中心提供賴氨酸生產用菌。

1.1.2 實驗配方

三級種子基礎配方:MnSO4質量2 kg,FeSO4質量2 kg,KH2PO4質量60 kg,K2HPO4質量60 kg,(NH4)2SO4質量250 kg,MgSO4質量30 kg,玉米漿體積2.0 m3,消泡油質量6 kg,銅鋅質量適量,定容體積35 m3。

發(fā)酵底料基礎配方:MnSO4質量25 kg,FeSO4質量25 kg,KH2PO4質量160 kg,K2HPO4質量160 kg,H3PO4質量100 kg,(NH4)2SO4質量800 kg,MgSO4質量250 kg,玉米漿體積5.0 m3,消泡油質量200 kg,銅鋅質量適量,定容體積240 m3。

總氮基礎配方:MnSO4質量20 kg,FeSO4質量20 kg,KH2PO4質量250 kg,K2HPO4質量250 kg,MgSO4質量500 kg,消泡油質量100 kg,定容體積30 m3。

1.1.3 實驗設備

體積為2 500 L的二級種子培養(yǎng)罐,5 000 L的三級種子培養(yǎng)罐,47 000 L的發(fā)酵罐,20 000 L配料罐,三級種子連消系統(tǒng),底料連消系統(tǒng),濃糖連消系統(tǒng),硫銨連消系統(tǒng),濃糖流加罐,硫銨流加罐,720型紫外分光光度計,100 mL容量瓶,0～1 000 mL移液槍,1 mL移液管,吸耳球,洗瓶等。

1.2 實驗設計

在現有三級種子基礎配方上分別用質量濃度0.3,0.5,0.7,0.9 g/L的磷酸甜菜堿替代氯化膽堿,定容30 m3,接種量體積為1 500 L,OD為0.5的二級種子液,培養(yǎng)溫度30 ℃,PH實測6.95,溶氧控制>30%,初糖流加量均不變,在成熟凈OD均為0.45的情況下對比成熟周期,確定成熟周期最短時磷酸甜菜堿的用量即為最佳用量。

在現有總氮配方基礎上添加磷酸甜菜堿,設計起始流加時間、總氮中磷酸甜菜堿添加濃度、糖氮比(濃糖與總氮的流加體積比)的三因素多水平正交實驗,對比轉化率得出最佳添加質量濃度、流加起始時間和糖氮體積比。

1.3 分析測定方法

1.3.1OD值檢測方法

取1 mL發(fā)酵液,用100 mL容量瓶稀釋100倍,使用720型分光光度計在600 nm波長下檢測OD值。

1.3.2 發(fā)酵液中賴氨酸質量濃度的測定

賴氨酸質量濃度采用茚三酮顯色法測定。

步驟1用賴氨酸標樣配置質量濃度為10 g/L賴氨酸鹽酸鹽標液,分別取2,3,4,5,6 mL賴氨酸鹽酸鹽標液至100 mL容量瓶中,用去離子水定容至100 mL,得到質量濃度分別為0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L的賴氨酸鹽酸鹽標樣。

步驟2發(fā)酵液稀釋150～500倍數,用離心機3 500 r/min離心10 min,得到樣品上清液。

步驟3用1支10 mL試管,取pH 1.3的茚三酮溶液1 mL,加入樣品離心上清液1 mL,再用5支10 mL試管,各取PH 1.3的茚三酮溶液1 mL,分別加入質量濃度為0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 g/L的賴氨酸鹽酸鹽標樣1 mL,搖勻后在沸水浴中加熱10 min,取出冷卻至室溫,在以上6支試管中繼續(xù)各加8 mL去離子水,搖勻后用720型分光光度計在475 nm波長下檢測吸光值。

步驟4在Excel中以賴氨酸鹽酸鹽標樣質量濃度為縱坐標,吸光值為橫坐標繪制標準曲線,得出標準曲線公式,再將樣品吸光值代入標準曲線公式中計算出發(fā)酵液中賴氨酸質量濃度。賴氨酸發(fā)酵糖酸轉化率計算公式為

糖酸轉化率=(產量/加糖量)×100%

1.4 數據統(tǒng)計方法

1)采用SAS隨機區(qū)組分析法分析磷酸甜菜堿對三級種子活力影響。

2)采用SPSS軟件設計影響磷酸甜菜堿流加因素的正交實驗,并對實驗結果做方差分析,確定最佳流加條件。

統(tǒng)計方法分析結果中的F表示自變量對因變量的影響大小;p表示自變量對因變量影響大小的顯著度,當p>0.05時表示影響不顯著或無統(tǒng)計學意義,當0.01

2 結果與分析

2.1 磷酸甜菜堿對賴氨酸三級種子活力的影響

通過在賴氨酸三級種子配方中添加不同質量濃度的磷酸甜菜堿,培養(yǎng)周期均為12 h,培養(yǎng)過程中每2 h檢測1次OD值,記錄得到表1實驗數據,根據表1數據繪制圖1曲線。成熟周期指種子OD值達到成熟OD值時的種子培養(yǎng)周期,可通過繪制種子OD生長曲線看出,曲線斜率最大(即菌體分裂速率最快)的周期確定為成熟OD值。

表1 磷酸甜菜堿三級成熟周期影響結果

圖1 三級種子OD生長曲線圖

通過SAS軟件對表1中2～5批次實驗數據作隨機區(qū)組方差分析,結果如下:

1)本例模型(ODij=U+Xi+Yj,X為添加量,Y為培養(yǎng)周期)的F=329.7,p=0.000 1<0.05,說明模型有統(tǒng)計學意義。

2)磷酸甜菜堿添加量的F=10.62,p=0.000 1<0.05,說明各區(qū)組均數之間有顯著差異,即不同磷酸甜菜堿添加量對三級種子OD值影響顯著。

3)不同培養(yǎng)周期的F=584.97,p=0.000 1<0.05,說明各處理組均數之間的差異有統(tǒng)計學意義,即三級種子隨著培養(yǎng)時間延長OD不斷增高。

從表1中可以看出:磷酸甜菜堿添加量0.3 g/L和0.5 g/L時對三級種子OD值影響最顯著,當磷酸甜菜堿添加量提高至0.7 g/L和0.9 g/L時對三級種子OD值影響顯著性降低。

綜合實驗結果及數據分析得出結論:三級種子配方中添加量0.5 g/L磷酸甜菜堿可替代0.5 g/L的氯化膽堿,而且磷酸甜菜堿能顯著提高種子活力,縮短成熟周期1.5 h。

通過配對T檢驗考查添加量0.3 g/L磷酸甜菜堿與添加量0.5 g/L氯化膽堿對三級種子OD值是否有顯著差異,分析結果如表2所示,其中p=0.692>0.05表示2組數據無顯著差異,即可用磷酸甜菜堿替代原配方中的氯化膽堿。

表2 配對T檢驗試驗1,2批次之間的OD差異

2.2 磷酸甜菜堿對賴氨酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵罐配方中添加磷酸甜菜堿,質量濃度分別為0,0.3,0.5,0.7,0.9 g/L,每個質量濃度實驗3批次,每2 h檢測1次OD值,并繪制各質量濃度條件下發(fā)酵罐OD曲線如圖2所示,同時得出發(fā)酵罐配方中添加不同質量濃度磷酸甜菜堿對發(fā)酵指標影響的實驗結果如表3所示。通過SPSS軟件分析表3實驗數據,得出結果見表4。通過在賴氨酸發(fā)酵底料中添加一定量的磷酸甜菜堿,發(fā)酵OD峰值、放罐產酸和轉化率(p=0<0.01)均顯著提高,其中OD峰值、放罐酸與磷酸甜菜堿添加量成正相關,而且當添加量由0.5 g/L提高到0.9 g/L時,發(fā)酵罐穩(wěn)定期顯著延長(圖2)。隨著發(fā)酵OD值增高,發(fā)酵轉化率表現略微下降趨勢?？傮w看賴氨酸發(fā)酵底料中添加磷酸甜菜堿的質量濃度為0.5 g/L時轉化率最高71.18%,發(fā)酵液中L-賴氨酸質量濃度263 g/L。

圖2 磷酸甜菜堿對發(fā)酵OD曲線影響圖

表3 磷酸甜菜堿對發(fā)酵指標的影響

表4 方差分析結果

2.3 總氮配方中添加磷酸甜菜堿對賴氨酸發(fā)酵的影響

以發(fā)酵運行中總氮起始添加時間(A)、磷酸甜菜堿在總氮中添加質量濃度(B)、糖與氮的體積比(C)為3個考查因素,以賴氨酸轉化率為因變量,采用SPSS軟件設計三因素五水平正交實驗,實驗結果如表5所示,SPSS軟件對實驗結果表5進行分析,其結果如表6所示。

表5 正交實驗結果

表6 主體間效應的檢驗

從表6中可以看出:該模型p=0.001<0.01,說明模型極顯著,R2=0.886,R2越接近1,說明模型擬合度良好,方程的顯著性及可靠性極高。Ⅲ平方和比較B>A>C,說明3個因素對轉化率影響大小依次為B,A,C。總氮中磷酸甜菜堿添加質量濃度(B)對賴氨酸糖酸轉化率影響極其顯著(F=12.934,p=0<0.01);起始流加時間(A)對賴氨酸糖酸轉化率影響極其顯著(F=7.94,p=0.002<0.01);糖氮體積比(C)對賴氨酸糖酸轉化率影響最小,不顯著(F=2.445,p=0.103>0.05)。

采用SPSS軟件對表5實驗數據方差分析,得出主因素A,B對賴氨酸轉化率影響的95%置信區(qū)間,其結果如表7,8所示。

表7 B因素對賴氨酸發(fā)酵轉化率的影響

由表7得出:總氮中磷酸甜菜堿添加質量濃度(B)為8 g/L時糖酸轉化率達到最高水平,置信區(qū)間最高(71.253%～71.319%),為最佳添加質量濃度;質量濃度低于4 g/L或高于12 g/L時糖酸轉化水平明顯下降。由表8得出:總氮起始流加時間(A)為5～7 h時,賴氨酸的糖酸轉化水平達到最高,置信區(qū)間最高(71.239%～71.305%),當9 h開始流加后,糖酸轉化率下降明顯。

表8 A因素對賴氨酸發(fā)酵轉化率的影響

3 討 論

三級種子活力、發(fā)酵罐OD峰值都影響著發(fā)酵罐指標,通過以往生產數據分析:當三級種子成熟周期大于9 h時,發(fā)酵罐OD峰值提前、耗糖速率下降,單產及轉化率等生產指標下降明顯,對生產極為不利。分析原因在于三級種子培養(yǎng)后期菌體密度增大,而通風、攪拌功率和罐壓都提高到了極限,造成種子長期缺氧,在逆生長環(huán)境下用于生產的基因工程菌為了適應生存,菌體內過表達的產酸促進基因片段會大量丟失,造成菌體增殖活性增加而產酸能力下降,最終導致發(fā)酵指標顯著下降。添加一定量磷酸甜菜堿起到了以下3個重要作用:

1)維持和調節(jié)細胞滲透壓。當外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時,細胞吸收或合成的甜菜堿通過穩(wěn)定蛋白質結構、提高鉀鈉泵功能、阻止胞內水分丟失等方式增加細胞對滲透壓的抗性[10]。

2)參與甲基化反應。甲基參與DNA甲基化反應[11],生產菌的遺傳物質DNA經過甲基化修飾,其遺傳及表達穩(wěn)定性提高,有利于賴氨酸發(fā)酵過程中菌體產酸能力的保持。而甜菜堿分子中含有3個甲基,DNA甲基化修飾提供了甲基供體。在甲基化反應中,甜菜堿-高半胱氨酸甲基轉移酶能夠催化甜菜堿向高半胱氨酸轉移一個甲基,分別生成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸,后者為VB12的合成提供甲基[12]。而甲硫氨酸、VB12都有利于賴氨酸生產菌生長繁殖。

3)磷酸甜菜堿中的磷酸根離子提高培養(yǎng)基中的溶磷,溶磷是限制菌體生長的主要因素,它參與菌體細胞壁、細胞膜構成,同時磷參與葡萄糖磷酸化分解以及ATP,AMP和AGP等能量物質的轉化。因此磷酸甜菜堿替代氯化膽堿后,三級種子成熟周期、發(fā)酵罐OD峰值周期都明顯縮短。

三級種子及發(fā)酵罐底料中添加磷酸甜菜堿后將三級種子成熟周期縮短1.5 h,發(fā)酵罐OD由對照組均值0.727提高到0.875,發(fā)酵產酸較對照組提高10 g/L,轉化率也有一定提升但不顯著。原因分析有兩點:

1)在于賴氨酸發(fā)酵過程有中間放料,隨著中間放料菌體及底料營養(yǎng)大量流失,造成OD峰值回降迅速,最終影響產酸及轉化率。工業(yè)化生產上通過在賴氨酸發(fā)酵過程中流加總氮的方式補充營養(yǎng),維持菌體中后期活性[13]。

2)菌體內合成的賴氨酸需要通過細胞膜賴氨酸外排泵排出胞外[14],在發(fā)酵中后期發(fā)酵液中賴氨酸質量濃度高與胞內質量濃度,造成細胞滲透壓增高。通過總氮添加一定量的磷酸甜菜堿,當發(fā)酵中后期外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時,細胞吸收的甜菜堿發(fā)揮其維持和調節(jié)細胞滲透壓的特性,能夠通過穩(wěn)定蛋白質結構、提高鉀鈉泵功能、阻止胞內水分丟失等方式增加細胞對滲透壓的抗性[15]。從而降低了發(fā)酵中后期破胞、提高了賴氨酸發(fā)酵轉換率。

4 結 論

現常用的發(fā)酵促進劑有氯化膽堿、甜菜堿鹽酸鹽和蛋氨酸等,其中前兩者含有大量氯離子不能被菌體利用,導致大量氯離子殘存于發(fā)酵液中,對發(fā)酵罐及后提取設備造成很大腐蝕,嚴重影響設備使用壽命,而且經常引起設備微漏造成發(fā)酵罐染菌。磷酸甜菜堿作為新型發(fā)酵促進劑,其中的磷酸根離子可以直接被菌體利用,甜菜堿可以參加甲基化代謝和調節(jié)細胞滲透壓,減少細胞破碎。研究表明:磷酸甜菜堿替代等量氯化膽堿,可顯著提高三級種子生長速率、縮短成熟周期。賴氨酸發(fā)酵OD值、放罐酸與底料中磷酸甜菜堿添加量成正相關,發(fā)酵配方中磷酸甜菜堿添加量為添加0.5 g/L時轉化率、產酸達到最優(yōu)?？偟辛姿崽鸩藟A最佳使用條件為:質量濃度為8 g/L、添加時間為發(fā)酵罐運行5～7 h、糖氮體積比控制在20～28。研究結果對降低賴氨酸生產成本、降低氯離子對設備腐蝕有指導意義。