陳沈梁,張?jiān)綈?李晨欣,沈詩(shī)瑩,吳玲彩,趙偉睿,胡 升,梅樂(lè)和,2

(1.浙大寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 寧波 315100;2.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310027)

高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)是因嘌呤代謝或排泄失常而導(dǎo)致血尿酸含量顯著超過(guò)正常范圍的慢性臨床綜合征[1]。HUA不僅是痛風(fēng)病癥發(fā)生的生化基礎(chǔ),而且也與糖尿病、心腦血管疾病及尿酸鹽腎病等慢性腎病的發(fā)生密切相關(guān),嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[2]。流行病學(xué)研究表明:隨著我國(guó)人民物質(zhì)生活水平的提高以及生活方式的改變,我國(guó)HUA發(fā)病率劇增,且呈年輕化趨勢(shì)[3]。目前,HUA的防治主要采用藥物控制和限制人體嘌呤物質(zhì)的攝入量。HUA治療藥物雖然有效但副作用大,長(zhǎng)期使用會(huì)造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)。對(duì)于飲食限制來(lái)說(shuō),由于高嘌呤食物眾多,嚴(yán)格限制飲食很難做到營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入平衡[4]。此外,由于鮮味物質(zhì)也屬于嘌呤類(lèi)物質(zhì)[5],因此高尿酸血癥患者也必須限制雞精等鮮味劑的攝入,這些無(wú)疑會(huì)使患者的生活質(zhì)量受到極大影響,患者往往難以堅(jiān)持。因此,尋找和開(kāi)發(fā)新型高效、副作用低或無(wú)副作用的HUA治療與預(yù)防方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

隨著對(duì)乳酸菌益生作用的關(guān)注,日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)具有高效嘌呤核苷分解能力的乳酸菌可以在腸道有效吸收并降解食物中的嘌呤核苷,從而降低人體對(duì)食物中嘌呤核苷的吸收量,起到控制嘌呤核苷攝入、降低血尿酸含量的目的[6]。應(yīng)用乳酸菌對(duì)HUA進(jìn)行防治可以避免或減輕傳統(tǒng)的嚴(yán)格飲食限制對(duì)患者生活質(zhì)量的影響[7]。目前,日本明治株式會(huì)社[8]、大冢制藥株式會(huì)社[8]已相繼篩選到多株具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌,并利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性,其中明治株式會(huì)社LactobacillusgasseriPA-3產(chǎn)品已進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用,而我國(guó)在該領(lǐng)域研究尚在起步階段[9]。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜為原料,對(duì)其中具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌進(jìn)行篩選和鑒定,并對(duì)其抗生素敏感性、酸性耐受能力、膽鹽耐受能力以及人工消化液耐受能力等生物學(xué)特性進(jìn)行考察[10],以期為研發(fā)我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的HUA輔助治療生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

寧波市售泡菜;MRS肉湯、藥物藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司;乳酸菌微量生化鑒定條,青島海博生物技術(shù)有限公司;溶菌酶、肌苷、鳥(niǎo)苷,生工生物工程(上海)股份有限公司;胃蛋白酶(USP級(jí),1∶3 000)、胰蛋白酶(BR,1∶250)、牛膽粉(40%膽酸),上海源葉生物科技有限公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;快速高保真DNA聚合酶,北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 嘌呤核苷降解菌的篩選

篩選方法參考Tsuboi等[7,11]的方法進(jìn)行,略有改動(dòng)。利用MRS固體平板分離得到泡菜中的單菌落,將獲得的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,獲得種子培養(yǎng)基。離心收集適量菌體,經(jīng)0.9% NaCl徹底重懸清洗后,向其中加入750 μL反應(yīng)液(含有1.26 mmol/L肌苷、1.26 mmol/L鳥(niǎo)苷的0.1 mol/L K3PO4溶液(pH 7.0)),于金屬浴37 ℃,800 r/min反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后,100 ℃處理5 min終止反應(yīng)。離心取上清,測(cè)定剩余肌苷、鳥(niǎo)苷降解率[10]。肌苷、鳥(niǎo)苷降解率計(jì)算公式為

1.3 肌苷、鳥(niǎo)苷的HPLC檢測(cè)方法

采用高效液相色譜法(HPLC)[12]測(cè)定肌苷和鳥(niǎo)苷的降解率。色譜條件:反相色譜柱,Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相V(0.01 mol/L KH2PO4)∶V(色譜甲醇)=95∶5;流速1 mL/min,測(cè)定波長(zhǎng)260 nm,柱溫30 ℃。

1.4 菌株的鑒定

采用生化反應(yīng)和16S rDNA序列比對(duì)兩種方法進(jìn)行菌種鑒定。糖發(fā)酵反應(yīng)按乳酸菌微量生化鑒定條說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。16S rRNA同源比對(duì)鑒定:提取乳酸菌的基因組,利用16S rRNA通用引物(16sF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16sR:GGCTACCTTGTTACGACTT)通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增菌種的16S rDNA基因片段。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃,5 min;(95 ℃,1 min;50 ℃,30 s;72 ℃,60 s)×32;72 ℃,5 min;冷卻至4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證后送于生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果于GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析[13],并利用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 抗生素敏感性試驗(yàn)

利用紙片瓊脂擴(kuò)散法[14-15],測(cè)定菌種對(duì)不同抗生素的敏感程度。將藥物敏感紙片均勻分布在含有一定量種子培養(yǎng)基的MRS固體平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,測(cè)量抑菌圈直徑。

1.6 菌株對(duì)酸耐受性、膽鹽耐受性的測(cè)定

1.6.1 酸耐受性測(cè)定

將種子培養(yǎng)基置于pH分別為6.2(對(duì)照),2,3,4的MRS液體培養(yǎng)基并混勻,37 ℃下處理0,1,2,4 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[16-17]。

1.6.2 膽鹽耐受性測(cè)定

以2%的接種量將種子培養(yǎng)基分別接種到牛膽粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0(對(duì)照)和0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃下靜置培養(yǎng),分別在0,4,12,24 h涂布,測(cè)定活菌數(shù)[14]。

1.7 菌株人工消化液耐受性及飽腹人工消化液下嘌呤降解情況

分別考察菌株在空腹、飽腹?fàn)顟B(tài)下的人工消化液的耐受能力。人工胃液:3.33%胃蛋白酶;人工腸液(g/L):NaHCO312.5,胰酶0.9,膽鹽3.0,pH 6.8;營(yíng)養(yǎng)液(g/L):阿拉伯半乳糖1,膠質(zhì)2,木聚糖1,土豆淀粉3,蛋白胨1,酵母粉3,黏蛋白4,L-半胱氨酸0.5,葡萄糖0.4?？崭?fàn)顟B(tài):人工胃液(HCl調(diào)整pH=2)和人工腸液。飽腹?fàn)顟B(tài):用營(yíng)養(yǎng)液配制的人工胃液(pH=3)和人工腸液。耐受性的測(cè)定:將種子培養(yǎng)基重懸于人工胃液中,37 ℃,800 r/min處理2 h,離心收集菌體,重懸于的人工腸液中,37 ℃,800 r/min處理4 h;從重懸于人工胃液開(kāi)始,每隔2 h進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

測(cè)定菌株在模擬飽腹人工腸液環(huán)境下嘌呤降解能力。離心收集適量菌體,用0.9% NaCl充分清洗,將菌體分別重懸于750 μL肌苷和鳥(niǎo)苷濃度都為1.26 mmol/L的飽腹人工腸液,37 ℃,800 r/min反應(yīng)1 h后測(cè)定嘌呤核苷降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效降解嘌呤核苷乳酸菌的篩選

從寧波市售泡菜中分離得到56株乳酸菌,采用高效液相色譜法測(cè)定其嘌呤核苷降解能力,結(jié)果如表1所示,所有菌株雖然都有一定程度的嘌呤核苷降解能力,但降解能力差異較大,其中4號(hào)和5號(hào)菌株對(duì)肌苷、鳥(niǎo)苷的降解能力最高,超過(guò)了95%,與日本研究者Kaneko等[18]篩選獲得的HUA輔助治療菌株降解能力(核苷嘌呤降解效果均接近100%)相似。此外,所有菌株自身對(duì)肌苷、鳥(niǎo)苷的降解能力趨于一致,這與Kaneko等[18]的研究結(jié)果也相一致。

表1 篩選菌株嘌呤降解率記錄表

2.2 菌株的鑒定

對(duì)4號(hào)和5號(hào)菌株進(jìn)行菌種鑒定,菌株糖利用結(jié)果如表2所示,與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)4,5號(hào)菌株的糖利用特性完全一致,且與短乳桿菌(Laclobacillusbrevis)基本符合。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增4號(hào)和5號(hào)菌株的16S rRNA,并進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果如圖1所示。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST分析,發(fā)現(xiàn)兩菌株的16S rRNA序列比對(duì)完全一致,且都與Lactobacillusbrevisb4的同源性為99%。結(jié)合糖利用結(jié)果,確定4號(hào)菌和5號(hào)菌為同一來(lái)源菌株,選取4號(hào)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收集不同種屬菌株的16S rRNA序列,用MEGA軟件,進(jìn)行進(jìn)化遺傳、系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2),可知4號(hào)菌株與L.brevis位于同一個(gè)簇群。因此,確定4號(hào)菌株屬于短乳桿菌。

表2 菌株糖類(lèi)利用特性表

圖1 strain 4的16S rDNA測(cè)序結(jié)果

圖2 菌體16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株的抗生素敏感性

鑒定乳酸菌的藥敏譜,是乳酸菌安全性評(píng)估與使用的必要部分[19]。從表3可知:4號(hào)菌株對(duì)哌拉西林、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素如紅霉素和頭孢哌酮抗生素的敏感程度較高,尤其對(duì)哌拉西林最為敏感;而在含有苯唑西林紙片的培養(yǎng)基上無(wú)抑菌圈,在含有青霉素的培養(yǎng)基上抑菌圈的直徑較小,可知菌株對(duì)苯唑西林、青霉素的敏感程度較低或不敏感。

表3 4號(hào)菌株抗生素敏感性結(jié)果表

2.4 菌體的酸、膽鹽耐受性

良好的酸耐受性、膽鹽耐受性是乳酸菌能夠在人體內(nèi)發(fā)揮生理功能的前提,因此有必要對(duì)篩選菌株的酸耐受性、膽鹽耐受性進(jìn)行考察。4號(hào)菌株在不同的酸性條件下的存活狀況如圖3所示,pH=2的酸性環(huán)境對(duì)該菌的存活率影響較大,但在pH為3,4的條件下,該菌的存活數(shù)在4 h內(nèi)始終保持108cfu/mL以上。人體胃酸pH值在空腹或食用酸性食物時(shí),一般為1.5～2,而食用堿性食物時(shí),pH可達(dá)4～5,一般通常情況下pH=3[20-21]。以上結(jié)果,說(shuō)明4號(hào)菌株具備了耐受人體通常情況下胃酸環(huán)境的能力。

人體正常膽汁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。4號(hào)菌株在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的MRS培養(yǎng)基、37 ℃條件下處理4,12,24 h后,活菌數(shù)仍可達(dá)到108cfu/mL及以上且保持相對(duì)穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,說(shuō)明該菌具備耐受人體正常膽汁濃度的能力。

圖4 4號(hào)菌株耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 菌株人工消化液耐受性及飽腹人工消化液下嘌呤降解情況

乳酸菌能順利到達(dá)腸道并在腸道中存活是其發(fā)揮益生功能的關(guān)鍵,通過(guò)模擬人體的消化道環(huán)境,可以反映菌種在經(jīng)過(guò)人體胃腸道消化后的存活狀況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明:在空腹?fàn)顟B(tài)下,4號(hào)菌株經(jīng)過(guò)胃后,由于受到較低pH的脅迫,活菌數(shù)下降明顯;而在飽腹?fàn)顟B(tài)下,經(jīng)人工胃液和人工腸液的消化后,活菌數(shù)基本不受影響,表明該菌種經(jīng)人體飽腹?fàn)顟B(tài)胃腸道消化后,依然能保持較好的存活能力。因此,4號(hào)菌可在飯后服用,以便其能更好地發(fā)揮生理功能。實(shí)驗(yàn)證明:該菌種在飽腹人工腸液條件下嘌呤核苷基本降解完全,降解率均達(dá)96%以上,具備在人體腸道飽腹?fàn)顟B(tài)下降解食物中嘌呤核苷的能力。

圖5 4號(hào)菌株人工消化液耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

應(yīng)用具有高效嘌呤核苷降解能力的乳酸菌對(duì)高尿酸血癥(HUA)進(jìn)行輔助治療和預(yù)防,可以在一定程度上或完全解除HUA患者在飲食上的嚴(yán)格限制,提高其生活質(zhì)量。本研究從泡菜樣品中篩選得到的一株具有高效降解嘌呤核苷能力的菌株,經(jīng)糖酵解實(shí)驗(yàn)和16S rRNA序列比對(duì),確定4號(hào)菌株為短乳桿菌,該菌株對(duì)嘌呤核苷降解能力與日本科學(xué)家報(bào)道的最高活性菌株的降解能力基本一致;該菌對(duì)哌拉西林、紅霉素和頭孢哌酮等抗生素有高敏感性,且具有良好的耐酸、耐膽鹽和耐受飽腹人工胃腸液的能力,而且在飽腹的人工腸液中其嘌呤核苷降解能力不受影響。因此,該菌是開(kāi)發(fā)用于輔助治療和預(yù)防HUA微生態(tài)菌劑的備選優(yōu)良菌株。

致謝:在此特別鳴謝徐晨航、鄒培波參與實(shí)驗(yàn)。