陳佳薇 ， 陳靜靜 ， 張 濤 ， 江 波 *，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全國際聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫 214122）

大量研究已證明褐藻膠作為水溶性膳食纖維，具有抗菌、降血糖等生理特性[1-3]。 但天然褐藻膠是一種生物大分子， 相對分子質(zhì)量集中在4×105～8×106， 即使在低濃度下形成的溶液黏度也很高，流動性與適口性差，使其無法應(yīng)用到食品體系中發(fā)揮重要生理特性。 與天然褐藻膠相比，低相對分子質(zhì)量的褐藻膠不僅具有一定的成膜性，可減緩碳水化合物的吸收速度，同時具有較好的調(diào)節(jié)腸道菌群并可作為水溶性膳食纖維等特點[4]。 此外，多糖相對分子質(zhì)量分布寬度也是影響其生理特性的重要參數(shù)。因此，低相對分子質(zhì)量及相對分子質(zhì)量分布范圍較窄的褐藻膠的研究可為開發(fā)新功能性食品配料提供理論依據(jù)。

現(xiàn)在絕大多數(shù)的研究都集中在褐藻膠裂解酶上，且關(guān)于褐藻膠的降解方式大多利用物理或化學(xué)方法如伽馬射線法、超聲法、酸解法、氧化法，但降解效率低，反應(yīng)后期易發(fā)生糖鏈聚集[5-6]。 生物酶解法相比于物理化學(xué)法，反應(yīng)條件溫和，高效，且不會生成有害副產(chǎn)物[7]。 本實驗中，褐藻膠裂解酶來源于需鈉弧菌（Vibrio natriegens），是一種內(nèi)切酶，通過β-消除反應(yīng)作用于 O-β-1，4 糖苷鍵，并同時在 C4、C5 之間形成不飽和雙鍵。纖維素酶是一種復(fù)合酶體系，內(nèi)切型葡聚糖酶（EG）可降解纖維素分子的內(nèi)糖苷鍵O-β-1，4 糖苷鍵，迅速降低聚合度并產(chǎn)生外切型纖維二糖酶（CBH）作用的新鏈端，CBH 則以切割末端的纖維素鏈以釋放可溶性纖維二糖或葡萄糖。利用纖維素復(fù)雜的多酶體系，將其作為輔酶探究是否與褐藻膠裂解酶有高效地協(xié)同作用，增加纖維素酶的應(yīng)用范圍，為探究低相對分子質(zhì)量、窄相對分子質(zhì)量分布范圍的褐藻膠制備方式提供更多選擇。

關(guān)于可控酶解探究中酶解時間、 加酶量范圍，不同酶解作用方式對產(chǎn)物相對分子質(zhì)量特性的影響與酶解歷程中酶與糖鏈分子間的鏈剪切行為密切相關(guān)。 因此，深入觀測酶解歷程中鏈剪切行為有助于明確各降解條件范圍，獲得相對分子質(zhì)量特性滿足生理特性需求的系列褐藻膠降解產(chǎn)物。 目前關(guān)于纖維素、瓜爾膠和魔芋葡甘聚糖與各自特異性酶在酶解歷程中分子間的鏈剪切模型研究已有報道，而關(guān)于褐藻膠鏈剪切模型的研究仍是空白[9-10]。作者通過GPC-MALLS 法了解了酶解歷程中褐藻膠降解物相對分子質(zhì)量及相對分子質(zhì)量分布的變化規(guī)律，闡明了褐藻膠在兩種酶作用下的鏈剪切模型，以及兩種酶在酶解歷程中對相對分子質(zhì)量分布的變化規(guī)律，確定了滿足生理特性需求的系列褐藻膠降解產(chǎn)物的降解條件，為褐藻膠作為膳食纖維增補劑在食品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

褐藻膠：青島雙城有限公司提供；褐藻膠裂解酶：作者實驗室制備；纖維素酶：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

DAWN HELEOS Ⅱ 多角度寂光檢測器： 美國懷雅特技術(shù)公司產(chǎn)品；Triad 凍干機：美國Labconco公司產(chǎn)品；Milli-Q Integral Cabinet 3 超純水系統(tǒng)：美國密里博公司產(chǎn)品；VISCO 黏度計： 日本愛宕公司產(chǎn)品；透析袋：江蘇博美達生命科學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶的制備海藻酸鈉液體培養(yǎng)基：8 g/L 海藻酸鈉，8 g/L NH4Cl，30 g/L NaCl，1 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L CaCl2，2 g/L K2HPO4，0.05 g/L MnSO4·H2O，上述所有試劑溶解于去離子水中，并在121 ℃，滅菌20 min。 海藻酸鈉液體培養(yǎng)基既是種子液也是發(fā)酵液。 野生菌株需鈉弧菌以體積分數(shù)2%接種于種子液，28 ℃、200 r/min，連續(xù)培養(yǎng) 12 h。 接著種子液以體積分數(shù)2%接種于發(fā)酵液，37 ℃、200 r/min， 連續(xù)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液6 200 g，離心10 min，所得上清液為褐藻膠裂解酶粗酶液，貯藏于4 ℃冰箱中用于后期分析實驗。 纖維素酶粉末溶解于pH 7 的磷酸鹽緩沖液中，配置成1 mg/mL 的酶液，貯藏于4 ℃冰箱中待后期實驗使用。

1.2.2 酶活測定褐藻膠裂解酶酶活通過DNS 法測定。 DNS 配方：1 L 體系中，45 ℃加熱溶解 185 gC4O6H4KNa，6.35 g DNS，21 g NaOH，5 g C6H5OH，5 g Na2SO3。 溶液配置后，穩(wěn)定一星期后使用。

配置不同質(zhì)量濃度的無水葡萄糖標(biāo)準溶液：0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL。 取 0.3 mL 葡萄糖標(biāo)準溶液，加入1 mL DNS，沸水中反應(yīng)10 min，待冷卻后，加入 1 mL 水。 以 0 號管為空白，在550 nm 波長下，測定吸光度。 以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。 得到回歸方程：y=1.338x-0.231 6，R2=0.998。

褐藻膠裂解酶酶活性單位（IU）定義為在分析條件下，每毫升粗酶液每分鐘從底物中釋放1 μmol還原糖所需的酶量。 纖維素酶活力酶活性單位（IU）定義為在分析條件下，每毫升的酶液每分鐘從底物中釋放1 μmol 還原糖所需的酶量。

1.3 反應(yīng)體系制備

褐藻膠溶解于pH 7 的磷酸鹽緩沖溶液中，配置成質(zhì)量分數(shù)為1%的褐藻膠溶液。 反應(yīng)體系為150 mL，置于250 mL 的酶反應(yīng)器中，轉(zhuǎn)速600 r/min，預(yù)熱至反應(yīng)溫度35 ℃。

1.4 一步加酶法對褐藻膠降解程度影響

研究不同加酶量對褐藻膠降解程度的影響。 定時取樣，反應(yīng)液沸水中煮沸10 min 滅活，透析，冷凍干燥，測定褐藻膠在不同降解時間的降解程度。

1.5 分步加酶法對褐藻膠降解程度影響

褐藻膠裂解酶每次加酶量為2.56 U/g， 研究4種加酶方式對褐藻膠降解程度的影響。 定時取樣，反應(yīng)液沸水中煮沸10 min 滅活，透析，冷凍干燥。加酶方式如表1 所示。

表1 分步水解法加酶方式Table 1 Enzymatic addition methods of interval hydrolysis

1.6 相對分子質(zhì)量參數(shù)測定

相對分子質(zhì)量 （Mw，Mn） 及分散系數(shù) （PDI）由GPC-MALLS 測 定 。 采 用 Ultrahydrogel 2000 和Ultrahydrogel 500 兩根柱子串聯(lián)，樣品質(zhì)量濃度5 mg/mL，0.22 μm 濾膜過濾，進樣量 200 μL，流動相為 0.1 mol/L 的 NaNO3溶液， 流量 0.6 min/mL，柱溫箱溫度35 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠裂解酶一步法重均相對分子質(zhì)量變化

酶解反應(yīng)時間控制在6 h，反應(yīng)溫度35 ℃，圖1顯示了褐藻膠裂解酶一步法降解方式對天然褐藻膠相對分子質(zhì)量的影響。在2 h 反應(yīng)時間內(nèi)，產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量整體隨酶活增加而降低，說明水解程度隨酶活增加而升高。 酶添加量2.56 U/mg 和3.84 U/mg 水解所得產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量無明顯差異，結(jié)果見表2。圖2 顯示，酶添加量對褐藻膠降解程度的影響。反應(yīng)進程控制在2 h 內(nèi)時，隨著酶活的增加降解程度升高，相對分子質(zhì)量間差異明顯；反應(yīng)進程控制在2 h 以上時， 隨著酶活的增加降解程度變化趨勢緩慢，當(dāng)酶添加量高于5.12 U/mg 時，降解程度趨于平緩，相對分子質(zhì)量間無明顯差異甚至出現(xiàn)相對分子質(zhì)量略微上升的趨勢。 Zhang 等人在研究纖維素酶水解纖維素過程中也出現(xiàn)相同現(xiàn)象[8]，是因為反應(yīng)體系中始終存在未水解或者難水解的大分子片段多糖鏈[9-10]。結(jié)合表2 中相對分子質(zhì)量及相對分子質(zhì)量分散系數(shù)的變化， 在相同反應(yīng)時間內(nèi)，隨反應(yīng)時間延長至2 h 以上， 相對分子質(zhì)量與酶添加jgjf 的正相關(guān)關(guān)系變?nèi)酰?且相對分子質(zhì)量分布范圍變寬，這可能是因為隨著加酶量的增加，褐藻膠裂解酶與難水解的大相對分子質(zhì)量片段結(jié)合，增加了體系中高相對分子質(zhì)量組分[11]。

圖1 褐藻膠裂解酶一步法反應(yīng)時間對降解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of reaction time on the molecular weight of hydrolysates by alginate lyase one step hydrolysis

圖2 褐藻膠裂解酶一步法酶添加量對降解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of enzymati cactivity on the molecular weight of hydrolysates by alginate lyase one step hydrolysis

2.2 分步法重均相對分子質(zhì)量變化

分步法按照表1 所示加酶，4 種分步加酶降解過程中相對分子質(zhì)量的變化情況如圖3 所示，具體數(shù)據(jù)如表2 所示。 褐藻膠裂解酶分步降解過程中，隨著反應(yīng)時間的增加，相對分子質(zhì)量始終保持下降的趨勢。 1 h 內(nèi)產(chǎn)物降解程度較低，重均相對分子質(zhì)量為467 900， 與褐藻膠初始相對分子質(zhì)量相比無明顯差異。反映進程在2 h 和3 h 時降解程度增加，相對分子質(zhì)量分別降至247 000 和148 500，相對分子質(zhì)量分別相比于上一階段下降2.0 倍和1.6 倍。反應(yīng)進程在4～5 h 時降解程度減緩， 相對分子質(zhì)量相較于上一階段均下降0.78 倍，最終在6 h 相對分子質(zhì)量變化程度趨于平緩。 反應(yīng)初始階段相對分子質(zhì)量變換緩慢是因為酶是一種生物大分子，褐藻膠溶液在水溶液中會形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且反應(yīng)初始階段加入的酶活較低，影響生物大分子酶與褐藻膠糖鏈的充分接觸，從而使得初始階段降解緩慢。

圖3 分步法相對分子質(zhì)量-時間變化曲線Fig.3 Effect of reaction time on the molecular weight of hydrolysatesby interval hydrolysis methods

與褐藻膠裂解酶分步法相比，雙酶降解過程中3 種加酶方式iACS、iACM、iACE 在反應(yīng)初始階段降解速率明顯高于褐藻膠裂解酶單酶分步降解，相對分子質(zhì)量在 1 h 內(nèi)分別下降 5.8，5.1 和 3.5 倍，而反應(yīng)進程延長至1 h 以上，3 種加酶方式下相對分子質(zhì)量隨反應(yīng)時間的增加，產(chǎn)物相對分子質(zhì)量間波動較小。 從1 h 內(nèi)相對分子質(zhì)量變化可以得出纖維素酶可以高效協(xié)同褐藻膠裂解降解大分子糖鏈，其中iACS 同步加酶的方式水解效率最高， 其次是iACM和iACE。但在1 h 后兩者協(xié)同水解效率發(fā)生迅速下降，這可能是因為反應(yīng)體系中不同相對分子質(zhì)量組分發(fā)生變化，從而影響纖維素酶與褐藻膠裂解酶對不同組分的選擇優(yōu)先性，具體情況需進一步分析相對分子質(zhì)量分布變化規(guī)律。

2.3 褐藻膠裂解酶產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布變化

依據(jù)表2 獲得的數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）和重均相對分子質(zhì)量（Mw），關(guān)于水解過程中產(chǎn)物的分散系數(shù)PDI 可以計算出來。這里使用Cooper 提供的關(guān)于Mn和Mw的具體計算方法作為參考[12]。

重均相對分子質(zhì)量主要受到高相對分子質(zhì)量組分的影響，而數(shù)均相對分子質(zhì)量主要受到低相對分子質(zhì)量組分的影響。 故水解過程中Mw和Mn的變化趨勢以及分散系數(shù)的變化是酶與糖鏈剪切行為在產(chǎn)物相對分子質(zhì)量變化角度上的體現(xiàn)。 基于以上理論，通過圖4、表2 和表3 可以推斷褐藻膠裂解酶在降解過程中的鏈剪切行為。 褐藻膠初始分散系數(shù)為 1.75，相對分子質(zhì)量范圍在 0.1×106～8×106，其中質(zhì)量分數(shù) 2×105～6×105占 90%。 圖4 是褐藻膠裂解酶分步法中產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布圖， 更能直觀體現(xiàn)出鏈剪切模型在相對分子質(zhì)量上的變化規(guī)律。 隨著褐藻膠裂解酶的加入， 在反應(yīng)1 h 時出現(xiàn)了低相對分子質(zhì)量組分 Mw＜1×105。 隨著酶的再次加入，產(chǎn)物的低相對分子質(zhì)量組分交替出現(xiàn)， 相對分子質(zhì)量中 Mw＜1×105的組分被水解至更小， 超出 GPCMALLS 檢測下限，無法顯示在圖中。 整個反應(yīng)過程中分散系數(shù)整體是呈現(xiàn)上升趨勢， 并始終高于初始值，這種變化與鏈非隨機剪切模型相似，Banks 等對纖維素與纖維素酶的非隨機剪切模型研究中也呈現(xiàn)類似現(xiàn)象[13]。 非隨機剪切模型主要是因為酶對底物的單次剪切和多次剪切的結(jié)合， 單次剪切指酶與底物每次接觸只剪切一個底物分子一個糖苷鍵； 多次剪切是指酶對一個底物分子一次剪切后， 仍然存留在該底物上并繼續(xù)對已斷裂的底物進行多次剪切。褐藻膠質(zhì)量分數(shù)已超過纏結(jié)質(zhì)量分數(shù)， 形成密度不均勻的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 使得褐藻膠裂解酶無法自由擴散。隨著低相對分子質(zhì)量出現(xiàn)，酶在該組分間的擴散速率增加，剪切概率增加，故出現(xiàn)低相對分子質(zhì)量累積現(xiàn)象。Ballauff 等指出酶分子與糖鏈的相互作用機制與中央剪切規(guī)律非常接近， 即酶對底物糖苷鍵的剪切存在中央優(yōu)先的特點[14]。 Cheng 等也指出酶分子對瓜爾豆膠的鏈剪切模型為中央剪切[15]。 本實驗中褐藻膠裂解酶與褐藻膠的鏈剪切模型屬于多次剪切模型和中央剪切模型的結(jié)合，且組分水解優(yōu)先性伴隨著糖鏈分子尺寸變化而變化。 如圖5 所示，初始階段通過中央剪切和多次剪切的方式迅速水解 Mw＞1×105的相對分子質(zhì)量多糖鏈， 當(dāng) Mw≤1×105的組分增加時， 褐藻膠裂解酶優(yōu)先吸附該類多糖，少部分吸附于未水解長鏈多糖進行非隨機型剪切。 隨著Mw≤1×105組分多糖進一步水解至低于Mw＜1×104，其溶液中擴散速率增加，不易與酶發(fā)生有效碰撞，故酶與擴散速率慢的大分子糖鏈結(jié)合進行剪切。

表2 不同降解方式對相對分子質(zhì)量的影響Table 2 Effect of different hydrolysis methods on the molecular weight of hydrolysates×105

圖4 褐藻膠裂解酶分步法相對分子質(zhì)量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution of alginate lyase interval hydrolysis

表3 不同水解方式對分散系數(shù)的影響Table 3 Effect of different hydrolysis methods on the molecular weight distribution of hydrolysates

圖5 褐藻膠在兩種酶作用下的鏈剪切模型示意圖Fig.5 Schematic representation of the proposed mode for the degradation of algin by two enzymes

2.4 雙酶產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布變化

在表3 中，iACS 中相對分子質(zhì)量分散系數(shù)在初始階段明顯變寬，從原始的1.65 上升至5.14。 結(jié)合表2，iACS 中 Mn的下降速率（10.6 倍）明顯高于 Mw的下降速率（5.8）倍，說明纖維素酶的加入促進了低相對分子質(zhì)量組分的降解，使得Mn快速降低。 圖6中iACS 在1 h 時低相對分子質(zhì)量分布明顯變寬至1×103，而高相對分子質(zhì)量組分1×106大部分被降解至 1×105。 iACM 在第 5 小時時分散系數(shù)從 2.3 升高至 7.02， 圖6 中 iACM 第 5 小時時 1×104組分迅速增加，而高相對分子質(zhì)量1×105組分下降緩慢，所以造成分散系數(shù)明顯上升。 iACM 在降解過程中其分散系數(shù)在2 h 內(nèi)呈上升狀態(tài)， 后逐漸下降并趨近于分散系數(shù)2。 在高分子鏈的隨機剪切過程中，PDI 值隨反應(yīng)進行最終無限趨近于2。 若體系初始PDI 值高于2，則PDI 值逐漸下降并無限趨近于2；若PDI值低于2，則PDI 值逐漸上升并無限趨近于2。 說明iACE 在2 h 后的剪切模型與隨機剪切模型類似。

前期預(yù)實驗表明纖維素在單獨作用于褐藻膠裂解酶時產(chǎn)物相對分子質(zhì)量無明顯變化（未展示），而在與褐藻膠裂解酶水解過程中能產(chǎn)生協(xié)同作用并使相對分子質(zhì)量快速下降，說明纖維素酶中的內(nèi)切型葡聚糖酶起主要協(xié)同作用。 iACS 和iACM 中PDI 值的突然增大說明纖維素酶對相對分子質(zhì)量1×104～1×105組分有吸附優(yōu)先性， 因此出現(xiàn) PDI 值迅速升高的現(xiàn)象。 由此推測在雙酶反應(yīng)體系剪切行為如圖5（d）所示，底物先在褐藻膠裂解酶的作用下生成相對分子質(zhì)量 1×104～1×105組分， 從而誘導(dǎo)纖維素酶開始降解該組分糖鏈，前者主要作用于Mw≥1×105組分， 而后者主要作用于由 alginate lyase 降解高相對分子質(zhì)量組分產(chǎn)生的低相對分子質(zhì)量組分，最終表現(xiàn)出隨機剪切模型[16]。這可能與內(nèi)切型葡聚糖酶的底物結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合有關(guān)。 內(nèi)切型葡聚糖酶已被證實只作用于非晶體結(jié)構(gòu)[17]，而天然大分子褐藻膠溶液中糖鏈易發(fā)生聚集行為與氫鍵結(jié)合形成針狀晶體結(jié)構(gòu)[6]，故高相對分子質(zhì)量時內(nèi)切型葡聚糖酶無法作用于底物， 但隨著降解過程的進行，相對分子質(zhì)量下降，聚集行為減弱，內(nèi)切型葡聚糖開始作用于無晶體結(jié)構(gòu)的低相對分子質(zhì)量糖鏈。

圖6 褐藻膠裂解酶-纖維素酶分步法相對分子質(zhì)量分布Fig.6 The molecular weight distribution of alginate lyase-Cellulase interval hydrolysis

3 結(jié) 語

采用5 種降解方式作用于褐藻膠， 利用GPCMALLS 表征降解過程中系列褐藻膠降解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量、分散系數(shù)，分析2 種酶作用下的鏈剪切模型，確定了滿足生理特性需求的系列褐藻膠降解產(chǎn)物的制備條件范圍。 褐藻膠裂解酶在作用于褐藻膠時主要表現(xiàn)為中央剪切和多次剪切模型。 整個反應(yīng)進程中隨反應(yīng)時間的延長，相對分子質(zhì)量組分增加。 多次剪切行為的存在使得小分子片段不斷增加，酶與其發(fā)生有效碰撞的概率減少，并開始與溶液中的大分子長鏈或未降解長鏈結(jié)合，故在褐藻膠一步法降解過程中， 當(dāng)反應(yīng)時間超過2 h 出現(xiàn)相對分子質(zhì)量上升的情況。 同樣的原理也體現(xiàn)在酶添加量這一因素中。 同一反應(yīng)時間下，隨著加酶量的增加， 相對分子質(zhì)量未呈等比例下降， 在加酶量達10.24 U/mg 時相對分子質(zhì)量下降倍數(shù)減小，是因為酶量的增加提高了酶在低相對分子質(zhì)量片段間的濃度，從而提高了低相對分子質(zhì)量降解速度，但并未提高高相對分子質(zhì)量的降解速度。 故為了確保相對分子質(zhì)量組分的均一性，減少小相對分子質(zhì)量片段的積累，可采用以下方法：1）褐藻膠一步法降解過程應(yīng)該將反應(yīng)時間控制在2 h 以內(nèi)， 褐藻膠分步降解過程反應(yīng)時間控制在5 h 內(nèi)；2） 兩種方式加酶量控制在2.56～10.34 U/mg。在上述條件范圍內(nèi)可制備相對分子質(zhì)量在20 000～120 000，分散系數(shù)范圍在1.6～2.4 的系列褐藻膠降解產(chǎn)物。 雙酶作用中，纖維素多酶體系中的內(nèi)切型葡聚糖酶起主要協(xié)同作用。褐藻膠裂解酶主要作用于Mw≥1×105組分，纖維素酶主要作用于 1×104～1×105組分， 反應(yīng)后期呈隨機剪切模型。iACE 法有助于兩者充分發(fā)揮對不同相對分子質(zhì)量組分的吸附特性， 增加與底物結(jié)合概率，減少低相對分子質(zhì)量積累，確保相對分子質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。 但本次實驗的研究仍存在不足， 單次加酶量過高使得底物在2 h 內(nèi)相對分子質(zhì)量下降迅速，2 h 后相對分子質(zhì)量無明顯變化。