楊瑞娟 王橋美 彭文書 趙苗苗 李梅 嚴(yán)亮

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201;2 滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院 云南普洱 665000;3 普洱茶研究院 云南普洱 665000;

4 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 云南昆明 650201)

普洱茶是云南省地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品［1］，具有歷史性、原生態(tài)性、多樣性等特征［2］，普洱茶因其得天獨(dú)厚的地理?xiàng)l件和文化底蘊(yùn)，越來越受消費(fèi)者的喜愛，被評為中國茶葉區(qū)域公用第一品牌。

普洱茶是以云南大葉種［Camellia sinensis（Linn.） var.assamica（Masters） Kitamura］曬青毛茶為原料［3］，采用特定的加工工藝制成的具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉。按加工工藝及品質(zhì)特征的不同，將普洱茶分為普洱生茶和普洱熟茶2種類型。普洱生茶是指未經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的曬青毛茶，既可作為綠茶直接飲用， 又可通過人工發(fā)酵技術(shù)快速轉(zhuǎn)化為普洱熟茶［4］。普洱茶屬于后發(fā)酵茶，以陳為尊，俗稱“越陳越香”。一款優(yōu)質(zhì)普洱茶的形成離不開優(yōu)質(zhì)原料、精湛工藝、科學(xué)倉儲(chǔ)這3大要素，好的倉儲(chǔ)條件能促使普洱茶的風(fēng)味品質(zhì)逐漸得到改善，普洱茶存放以縮短倉儲(chǔ)時(shí)間，最大可能提高茶葉品質(zhì)，創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益［5］為目的，于是同法國葡萄酒、中國茅臺酒一樣，科學(xué)倉儲(chǔ)成了普洱茶生產(chǎn)工藝的一個(gè)重要組成部分。近年來，關(guān)于普洱茶倉儲(chǔ)的研究比較多［6-11］，但影響因子主要集中在水分、溫度、光照、氧氣、壓力等，微生物的研究尚未見報(bào)道。

目前，普洱茶發(fā)酵微生物的研究很多，但是普洱茶存放環(huán)境微生物的研究很少，與品質(zhì)結(jié)合的研究基本沒有，本文選取新興的普洱茶專業(yè)茶窖為研究對象，應(yīng)用純培養(yǎng)和測序技術(shù)對普洱茶窖的環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初探，并對茶窖存放的普洱茶的內(nèi)生菌和茶品質(zhì)進(jìn)行研究，旨在研究微生物群落結(jié)構(gòu)與普洱茶品質(zhì)變化之間的相關(guān)性，進(jìn)而為促進(jìn)普洱茶倉儲(chǔ)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和實(shí)際生產(chǎn)中普洱茶的倉儲(chǔ)存放提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樣

XY：從茶樹上直接采摘的茶鮮葉；

BC1：普洱茶壓餅成型后，自然環(huán)境存放，溫濕度隨著普洱市的氣候而變化；

BC2：普洱茶壓餅成型后，放置于普洱茶窖，常年恒溫恒濕（34.5℃，70%）保存。

BC1 和BC2 是同一批出廠的普洱茶，存放時(shí)間為兩年（2016年6月至2018年8月）。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂18 g/L；用途為篩選、培養(yǎng)細(xì)菌。

YEPD 培養(yǎng)基配方：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂分別為10、20、20、18 g/L；用途為篩選、培養(yǎng)酵母。

PDA 培養(yǎng)基配方：馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂分別為 300、20、（15～20）g/L；用途為篩選、培養(yǎng)真菌。

高氏培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉、氯化鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、7H2O硫酸鐵、瓊脂分別為20、0.5、1、0.5、0.5、0.01、（15～20）g/L；用途為篩選、培養(yǎng)放線菌。

1.2 方法

1.2.1 微生物的培養(yǎng)

1.2.1.1 茶窖中墻面、地面、水和菌斑微生物的采集和培養(yǎng)

將所采墻面和地面的土壤分別置于滅菌的培養(yǎng)皿中自然風(fēng)干1 周左右，取10 g 于90 mL 的無菌水中，振蕩20 min，使其中微生物充分分散，得到10-1倍樣品稀釋液。用無菌移液槍吸取10-1菌懸液1 mL，加入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩混勻，配制 10-2、10-3、10-4、10-5菌懸液，把 10-3、10-5兩個(gè)梯度的土懸液 100 μL 均勻涂于 LB、YEPD、PDA 和高氏培養(yǎng)基平板中。采集的水樣也用無菌水稀釋，同上所述，將10-3、10-5兩個(gè)梯度涂布于4種培養(yǎng)基。菌斑采集：用無菌的棉簽擦拭菌斑處，將棉簽放入無菌水中浸泡（無菌水能沒過棉簽即可），之后將菌懸液涂布于4種培養(yǎng)基。

1.2.1.2 茶樣內(nèi)生菌的培養(yǎng)

對茶樣進(jìn)行如下處理：經(jīng)無菌水沖洗10 min→2.5%硫代硫酸鈉浸洗10 min→5%次氯酸鈉浸洗3 min→75%乙醇浸洗5 min→再用無菌水沖洗10 min，用裝好已滅菌刀頭的組織粉碎儀對茶葉進(jìn)行破碎，之后將茶葉與無菌水比例為1∶9（10 克茶葉90 mL水）的比例進(jìn)行稀釋，制備成10-1的稀釋液，之后將10-3、10-42個(gè)濃度的稀釋液100 μL涂布到4種培養(yǎng)基上。

將涂布結(jié)束的LB 培養(yǎng)基平板倒置于37℃培養(yǎng)箱，將涂布結(jié)束的YEPD、PDA和高氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48～72 h，并對菌種進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，備用。

1.2.2 微生物的鑒定

將純化的微生物制成菌懸液進(jìn)行PCR 反應(yīng)［12-13］，細(xì)菌引物為 27F （5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′） 和 1492R （5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），真菌引物為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'） 和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），將擴(kuò)增成功的樣品送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中挑選與靶序列相似度為100%的參考菌株序列，查出相應(yīng)微生物，完成菌種鑒定。

用多序列對比軟件Clustal X 1.81 進(jìn)行同源性比較并匹配排序，然后用系統(tǒng)發(fā)育分析MEGA5.1軟件包分析，構(gòu)建鄰接（Neighbor-joining，NJ）樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。NJ 樹構(gòu)建采用HKY85 距離矩陣，啟發(fā)式搜索，Bootstrap（1 000 次重復(fù)）檢驗(yàn)，制作系統(tǒng)樹［14］。

1.2.3 茶品質(zhì)的鑒定

1.2.3.1 理化指標(biāo)的檢測

茶葉中的水浸出物、茶多酚、茶氨酸、咖啡堿、游離氨基酸總量和含氟量分別按著標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8305—2013 《茶 水浸出物測定》、GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T23193—2008（茶葉中茶氨酸的測定高效液相色譜法）、GB/T8312—2013（茶咖啡堿測定）、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》和GB/T5009.18—2003（食品中氟的測定）的規(guī)定檢測。茶多糖、茶色素分別按照可溶性糖-蒽酮比色法和直接萃取比色法［15］來檢測。

1.2.3.2 安全指標(biāo)的檢測

農(nóng)殘和致病菌檢測：由普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心完成，其中農(nóng)殘按照GB2763—2005《食品中最大農(nóng)藥殘留限量》的規(guī)定進(jìn)行檢測，致病菌按照GB29921—2013《食品中致病菌限量》的規(guī)定進(jìn)行檢測。

1.2.3.3 感官評定

由具有評茶職業(yè)資格的五位高級評茶員完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化的茶窖環(huán)境細(xì)菌群落組成分析

對純化得到的157株細(xì)菌（墻面、水和地面中分別分離到88 株、40 株、29 株）形態(tài)學(xué)去重復(fù)后進(jìn)行16S rRNA 基因測序、比對，挑取代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1 所示。茶窖環(huán)境中的細(xì)菌可以歸類到不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、伯克氏菌屬Burkholderia、色桿菌屬chromobacterium、棒狀桿菌屬corynebacterium、微小桿菌屬Exiguobacterium、馬賽菌屬M(fèi)assilia、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、微球菌屬M(fèi)icrococcus、假單胞菌屬Pseudomonas、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium、葡萄球菌屬Staphylococcus、鏈霉菌屬Streptomyces等屬中。

2.2 基于ITS 基因系統(tǒng)進(jìn)化的茶窖環(huán)境真菌群落組成分析

對純化得到的119株真菌（墻面、水和地面中分別分離到39 株、37 株、43 株）形態(tài)學(xué)去重復(fù)后進(jìn)行ITS基因測序、比對，挑取代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示。茶窖環(huán)境中的真菌可以歸類到曲霉屬Aspergillus、Blastobotrys、枝孢屬Cladosporium、附球菌屬Epicoccum、Meyerozyma、青霉菌屬Penicillium、根毛霉屬Rhizomucor等屬中。

圖1 采用鄰接法分析16S rRNA序列構(gòu)建的細(xì)菌系統(tǒng)樹

2.3 茶窖中菌斑的培養(yǎng)鑒定結(jié)果

對茶窖中長期累積的菌斑進(jìn)行取樣分析，分離鑒定得到的微生物結(jié)果如表1，菌落與標(biāo)準(zhǔn)株相似度均為100%，其中曲霉屬20 株，其中黑曲霉Aspergillus niger8 株，青霉屬Penicillium、枝孢菌屬Cladosporium、小球殼屬M(fèi)ycosphaerella等共計(jì)3屬，5株。

2.4 普洱茶內(nèi)生菌組成及屬間特征分析

對純化得到的163株（鮮葉、自然存放的茶和窖藏茶中分別分離到83、31、49 株）細(xì)菌形態(tài)學(xué)去重復(fù)后進(jìn)行16SrRNA 基因測序、比對，挑取代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3 所示。茶樣中的細(xì)菌可以歸類到無色桿菌屬Achromobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、短芽孢桿菌屬Brevibacillus、金黃桿菌屬Chryseobacterium、腸桿菌屬Enterobacter、草螺菌屬Herbaspirillum、泛菌屬Pantoea、拉烏爾菌屬Raoultella、黃桿菌屬Xanthomonas等屬中。

圖2 采用鄰接法分析ITS序列構(gòu)建的真菌系統(tǒng)樹

由表2可知，鮮葉、自然存放和窖藏茶的內(nèi)生菌群落均含有無色桿菌屬Achromobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、腸桿菌屬Enterobacter。鮮葉內(nèi)生菌共分離菌株83 株，分布于12 個(gè)屬，以芽孢桿菌屬Bacillus、金黃桿菌屬Chryseobacterium、無色桿菌屬Achromobacter、黃桿菌屬Flavobacterium、草螺菌屬Herbaspirillum和拉烏爾菌屬Raoultella為主要類群，其相對分離頻率依次為28.92%、 21.69%、 14.46%、 9.64%、 7.23% 和6.02%。自然存放茶共分離菌株31 株，分布于6 個(gè)屬，菌落豐富性不高，其中無色桿菌屬Achromobacter和腸桿菌屬Enterobacter相對分離頻率最高，均為35.48%，其次是芽孢桿菌屬Bacillus，相對分離頻率為19.35%。窖藏茶共分離菌株49株，分布于7個(gè)屬，菌落豐富度比自然存放的茶高，以芽孢桿菌屬Bacillus、無色桿菌屬Achromobacter和腸桿菌屬Enterobacter為主要類群，相對分離頻率依次為42.86%、22.45%和22.45%。

金黃桿菌屬Chryseobacterium、黃桿菌屬Flavobacterium、草螺菌屬Herbaspirillum、泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas、拉烏爾菌屬Raoultella、志賀氏菌屬Shigella和黃桿菌屬Xanthomonas在鮮葉中含有，而不同環(huán)境存放兩年的茶中沒有檢測到。埃希氏菌屬Escherichia、桿菌屬Geobacillus、細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacterium鮮葉中沒有檢測到，而存放兩年的茶中都有。自然存放和窖藏茶的微生物種類比較相似，唯一的不同是短芽孢桿菌屬Brevibacillus，自然存放的茶中沒有，而窖藏的茶中含有。

表1 茶窖中菌斑培養(yǎng)鑒定結(jié)果

2.5 普洱茶（生茶）內(nèi)含物及茶品質(zhì)結(jié)果

自然存放和窖藏茶的安全指標(biāo)（重金屬、農(nóng)殘、大腸菌落數(shù)和致病菌）結(jié)果顯示：鉛含量、大腸菌落數(shù)、氯菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、樂果、六六六、敵敵畏、滴滴涕、殺螟硫磷、喹硫磷和乙酰甲胺磷都不超標(biāo)，沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌等致病菌均未檢出。

由表3可知，自然存放和窖藏茶的水分、灰分和水浸出物都符合GB/T 22111—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品普洱茶》的規(guī)定，且茶多酚、咖啡堿、兒茶素、游離氨基酸、茶氨酸、茶色素（茶紅素、茶黃素、茶褐素和花青素）和氟化物的含量相差不大，唯一差別大的是茶多糖，窖藏茶茶多糖的含量是自然存放茶的兩倍。

感官評定結(jié)果顯示，自然存放茶餅形端正，色澤黃褐，表面光滑勻整，香氣純正，滋味醇和，湯色橙黃明亮，窖藏茶餅形端正，色澤黃褐，表面光滑勻整，香氣純正，滋味醇厚，湯色橙紅明亮，自然存放茶和窖藏茶原料都來自景邁山，所以香氣都是典型的蘭花香，相比之下，窖藏茶比自然存放茶的湯色更深，也說明內(nèi)含物轉(zhuǎn)化的更多更快。

3 討論與結(jié)論

茶窖是一個(gè)新興概念，所有的探索和研究尚處于初級階段，前期我們探索了茶窖中空氣微生物的分布特征，發(fā)現(xiàn)茶窖空氣微生物群落以鏈霉菌屬Streptomyces、曲霉屬Aspergillus、芽孢桿菌屬Bacillus和葡萄球菌屬Staphylococcus為主要類群［16］，本文又利用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法和分子生物學(xué)測序法相結(jié)合，對普洱茶茶窖中墻面、地面、水中的微生物和長期積累的菌斑進(jìn)行了分離和鑒定，對茶窖環(huán)境微生物的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，茶窖中墻面、地面和水中共有最多的微生物菌屬是曲霉屬Aspergillus和芽孢桿菌屬Bacillus（圖1、2），茶窖長期積累的菌斑也以曲霉屬Aspergillus為主。茶鮮葉和不同環(huán)境存放兩年的普洱茶內(nèi)生菌的分離和鑒定結(jié)果表明，鮮葉、自然存放茶和窖藏茶均含有大量的芽孢桿菌屬Bacillus，且均未分離到真菌。綜上所述，茶窖環(huán)境中最多的真菌屬為曲霉屬Aspergillus，最多的細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬Bacillus。

圖3 采用鄰接法分析16S rRNA序列構(gòu)建的細(xì)菌系統(tǒng)樹

經(jīng)過對不同存放環(huán)境中茶葉內(nèi)含物和口感的比較發(fā)現(xiàn)，自然存放茶的茶紅素高于窖藏茶，而茶褐素卻低于窖藏茶（表3），這說明窖藏茶轉(zhuǎn)化的更快，這跟普洱茶的發(fā)酵過程很相似，在普洱茶發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，茶紅素含量下降，茶褐素積累，茶褐素對普洱茶湯色紅褐品質(zhì)的形成具有至關(guān)重要的作用［17］，這也正可以解釋為什么存放時(shí)間一樣，而窖藏茶的湯色卻更深。本文中分離到的茶窖環(huán)境中的細(xì)菌和茶葉內(nèi)生菌以桿菌屬為主。有報(bào)道稱桿狀菌亦可以產(chǎn)生豐富的多酚氧化酶、過氧化物酶等，可以促進(jìn)兒茶素的轉(zhuǎn)化，有利于普洱茶品質(zhì)的提高［18］。付秀娟等［19］研究認(rèn)為，普洱茶發(fā)酵過程中，霉菌對茶褐素含量的影響最大，酵母次之，細(xì)菌最小。這次在茶窖環(huán)境中（空氣、水）分離到了黑曲霉，而且茶窖常年累積的菌斑經(jīng)過培養(yǎng)鑒定，一半以上是曲霉屬，且黑曲霉占大多數(shù)，這說明黑曲霉常年的聚集可能是影響茶品質(zhì)關(guān)鍵的因素，有學(xué)者研究證明，黑曲霉中的單寧酸、單寧酶具有降解和水解單寧，產(chǎn)生沒食子酸，使普洱茶湯色形成深紅色的作用［20-21］。在茶窖環(huán)境中還分離出了根霉屬真菌。齊祖同［22］和朱宏濤等［23］研究發(fā)現(xiàn)，根霉屬真菌（絲狀菌種產(chǎn)L-乳酸的一種重要菌種）具有獨(dú)特的凝乳酶，能集聚生成芳香的脂類物質(zhì)，這可能與本研究中茶的蘭花香有關(guān)系?？Х葔A是茶葉中主要的嘌呤堿，是構(gòu)成茶湯的重要滋味物質(zhì)，窖藏茶的咖啡堿略高于自然存放茶，也有可能是環(huán)境中大量的黑曲霉影響所致。有研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以顯著增加咖啡堿的含量［24］。王茹蕓等［25］研究發(fā)現(xiàn)，但隨著普洱茶貯藏時(shí)間的加長，普洱茶中游離氨基酸總量明顯降低，其中絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸已基本消減。本研究中窖藏茶中的游離氨基酸總量和茶氨酸的含量均低于自然存放茶，這更加說明窖藏茶比自然存放的茶轉(zhuǎn)化的更快。窖藏茶的咖啡堿略高于自然存放茶，但茶湯并不苦澀，滋味更加醇厚，這可能是因?yàn)槌士辔兜牟枞~生物堿（包括咖啡堿）與茶色素通過某種作用結(jié)合，

使其呈味物質(zhì)協(xié)調(diào)重組密切相關(guān)。

表2 鮮葉、自然存放與窖藏茶內(nèi)生菌細(xì)菌菌株數(shù)量及相對分離頻率（RF）

表3 窖藏茶倉儲(chǔ)茶理化指標(biāo)對比

本文利用平板稀釋涂布分離，獲取純的培養(yǎng)物（微生物菌株），再通過分子生物學(xué)技術(shù)及分類鑒定等手段進(jìn)行鑒定，進(jìn)而分析確定純培養(yǎng)物歸屬。在研究得到茶窖環(huán)境微生物群落組成和差異的同時(shí)，保存了大量微生物菌種資源，這與免培養(yǎng)方法相比具有極大優(yōu)勢。后續(xù)研究將通過檢索相關(guān)微生物資源信息及應(yīng)用，進(jìn)一步探究具有特定功能的微生物變化對茶葉品質(zhì)的影響。