范春雅 樊雪瓊 郭教玲 謝世瑩 李娟 周丹

(海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 海南?？?571199)

山地五月茶（Antidesma montanum），是大戟科五月茶屬植物，主產(chǎn)于廣東、海南、廣西等地。五月茶屬植物通常以根、葉、莖入藥，具有健脾、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、生津、活血、收斂、解毒等功效［1］。山地五月茶，在海南分布廣泛。民間常將其與眼樹蓮合用治療眼疾。前期研究表明，山地五月茶安全無毒，有很好的藥理活性和開發(fā)前景［2-3］。

黃酮類化合物是植物界分布最為廣泛的一大類次生物質(zhì)，具有很好的藥理生理活性，如治療心腦血管系統(tǒng)和消化、呼吸系統(tǒng)疾?。豢拱?、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌，消除自由基、抗氧化、抗衰老等，抗病毒及提高機(jī)體免疫力等，已被列為保健食品的一類功能因子［4-5］。黃酮的提取方法有溶劑提取法、吸附法、超臨界流體萃取法、堿溶酸沉法等。溶劑法是提取黃酮類化合物最常用的方法，此法操作簡(jiǎn)單、易行。李萍［6］用溶劑法提取蘋果屬植物葉片中的類黃酮，發(fā)現(xiàn)影響提取率的關(guān)鍵因素有提取劑濃度、料液比，其次為提取溫度和時(shí)間；此外，類黃酮在提取過程中可能會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，可采用在提取劑中加入BHT（二丁基羥基甲苯）、抗壞血酸等還原劑加以預(yù)防。黃酮的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等［7-10］。紫外分光法能快速地測(cè)出黃酮的含量，操作簡(jiǎn)便，因而得到廣泛應(yīng)用［11］。

本研究旨在探討山地五月茶總黃酮的提取工藝，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，為山地五月茶的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑

山地五月茶地上部分采自海南省萬寧市興隆縣，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院曾念開教授鑒定為山地五月茶（Antidesma montanum）。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)20771，上海源葉生物科技有限公司）、無水乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）、亞硝酸鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）、氫氧化鈉（西隴化工股份有限公司）、硝酸鋁（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。所有試劑級(jí)別均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器

UV 1800C型紫外可見分光光度計(jì)（上海鳳凰儀器有限公司）；AE100 型電子分析天平（南京庚辰科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 山地五月茶黃酮的提取與含量測(cè)定

1.2.1.1 山地五月茶黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取2 g 樣品粉末于100 mL 圓底燒瓶中，加入60%乙醇20 mL，于80℃下加熱回流提取2 h，離心過濾；提取3 次，合并濾液，用60%乙醇定容至100 mL，即得山地五月茶樣品溶液［12］。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，即得濃度為0.400 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液［13］；準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50 mL 于比色管中，分別加入5%NaNO2溶液1.00 mL，搖勻后靜置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1.00 mL，搖勻后靜置6 min，加入4% NaOH 溶液4.00 mL，用無水乙醇定容至10 mL，搖勻并靜置10 min，于500 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（g/L）為橫坐標(biāo)［10］，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.3 黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1.00 mL 樣品液于比色管中，按“1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”測(cè)定吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算黃酮得率。總黃酮得率公式如下（Y）：

Y=CV/M

式中：Y為黃酮得率，單位為1；C為提取液濃度，g/mL；V為提取液原始體積，mL；M為所稱取山地五月茶粉末質(zhì)量，g。

1.2.2 山地五月茶黃酮提取工藝優(yōu)化

以乙醇為溶劑對(duì)山地五月茶進(jìn)行加熱回流提取，結(jié)合單因素試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法對(duì)山地五月茶黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)山地五月茶加熱回流提取效果的影響（表1），黃酮含量測(cè)定方法同“1.2.1.3 黃酮含量的測(cè)定”。

表1 加熱回流提取的條件

1.2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用4 因素3 水平進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平如表2所示。自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1 進(jìn)行編碼，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。

表2 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與黃酮含量的測(cè)定

按“1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”，依次測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。線性方程為A=0.229 4C+0.023 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 山地五月茶黃酮提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

在提取時(shí)間為1 h、料液比為1∶40、提取溫度為60℃、提取3 次的條件下，考察不同乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 中可知，乙醇濃度對(duì)樣品中黃酮的提取影響較大，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的含量呈先升高而后下降的變化趨勢(shì)；當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，總黃酮含量最高。這說明山地五月茶中中等極性的黃酮苷類物質(zhì)含量比較高，當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí)，溶劑極性降低，導(dǎo)致部分黃酮苷類物質(zhì)不能溶解，某些脂溶性雜質(zhì)溶出，使黃酮提取率降低。因此，最佳乙醇濃度為50%。

2.2.1.2 料液比對(duì)加熱回流提取效果的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

在提取時(shí)間為1 h、乙醇濃度為60%、提取溫度為60℃、提取3 次的條件下，考察1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 料液比對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)料液比為1∶30 時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到峰值。繼續(xù)提高料液比，黃酮提取率反而下降。這可能是因?yàn)橐呀龅拇罅侩s質(zhì)影響了黃酮的浸出率；或者是因?yàn)橐呀龅拇罅奎S酮對(duì)剩余黃酮有協(xié)同浸提作用［9］。

圖3 乙醇體積對(duì)提取效果的影響

2.2.1.3 提取時(shí)間對(duì)加熱回流提取效果的影響

在提取溫度為60℃、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取3次的條件下，考察提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖4 所示。從圖4 可知，黃酮含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間為90 min 時(shí)，黃酮含量達(dá)到極值，之后又逐漸降低。因此，最佳提取時(shí)間為90 min。

2.2.1.4 提取溫度對(duì)加熱回流提取效果的影響

在提取時(shí)間為1 h、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取3次的條件下，考察不同溫度（50、60、70、80、90℃）對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖5 所示。從圖5 可知，黃酮含量隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在溫度為80℃時(shí)含量最高。這是因?yàn)樯郎丶铀倭它S酮類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散、溶解等，更有利于黃酮的提??；但過高的溫度易使黃酮類物質(zhì)氧化變性，從而導(dǎo)致提取率下降［7］。因此，最佳提取溫度為80℃。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

圖5 提取溫度對(duì)提取效果的影響

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.2.1 回歸方程建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為自變量，山地五月茶黃酮得率為因變量進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)（表2），共設(shè)計(jì)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝分析方案及結(jié)果如表3所示。

利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果見表4。由表4 可知，料液比（p＜0.01）和乙醇濃度（p＜0.50）對(duì)總黃酮的提取影響顯著。以山地五月茶中總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=0.866-2.95×10-3A+6.415×10-3B-0.015C-6.56×10-3D+3.75×10-5AB+5.5×10-5AC+2.5×10-5AD+3.5×10-5BC+1.08×10-5BD+6.92×10-5CD-7.02×10-5A2-1.08×10-4B2+3.67×10-5C2-2.04×10-6D2

表3 響應(yīng)面優(yōu)化分析方案

由表4 可知，該模型顯著（p= 0.0048＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著 （p= 0.9045＞0.05），決定系數(shù)R2=0.812 5，說明有81.25%的變差能夠由該模型解釋；變異系數(shù)CV為8.94%，說明變異（偏離）程度較小。因此，該模型具有良好的擬合度，能真實(shí)地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可對(duì)山地五月茶黃酮的提取條件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析［14］。

2.2.2.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

將2 個(gè)因素固定在0 水平，通過Design-Ex-pert 8.06 軟件統(tǒng)計(jì)分析，觀察其余2 個(gè)因素的交互作用。通過響應(yīng)面和等高線圖，分析各影響因素的響應(yīng)面交互作用。由圖6-a可知，響應(yīng)面坡度都比較陡峭，說明料液比（A）和乙醇濃度（B）對(duì)黃酮提取率影響較大［8］。由響應(yīng)面的等高線圖（圖6-b）可知，等高線為橢圓形，說明料液比和乙醇濃度這2個(gè)自變量間交互作用較強(qiáng)。通過軟件分析得知，山地五月茶總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度57.38%、料液比1∶39.58、提取溫度84.15℃，加熱回流提取101.13 min，在此條件下，預(yù)期山地五月茶黃酮得率可達(dá)到0.121 0。為實(shí)際操作方便，實(shí)際的最優(yōu)提取條件為乙醇濃度57%、料液比1∶39、提取溫度84℃，加熱回流提取100 min，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，山地五月茶總黃酮得率平均值為（0.118 9±0.02），與預(yù)測(cè)值接近，說明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

表4 方差分析

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了山地五月茶黃酮的提取工藝，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定了山地五月茶黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度57%、料液比1∶39、提取溫度84℃、加熱回流提取100 min，黃酮得率為（0.118 9±0.02）。

圖6 乙醇濃度和料液比交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

此提取工藝操作簡(jiǎn)便、工藝成熟、提取率高、綠色環(huán)保，將為山地五月茶的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。