朱凌威 張朝陽 劉 釗 李良玉 唐 洪 趙仲孟陳雨薇 武佳韻 黃小麗 楊世勇①

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 雅安 625014；3. 成都市農(nóng)林科學院水產(chǎn)研究所 成都 611130)

溫度是魚類生長發(fā)育過程中重要的環(huán)境因子，魚類作為變溫水生脊椎動物，溫度對其生長、代謝以及其他生理活動都具有重要影響(Elliott, 1995)。應激反應是魚類受到一個或多個外界環(huán)境因素的不良刺激作用所產(chǎn)生的非特異性反應(王國強等, 2009)。溫度應激會對魚類生長(楊健等, 2007; 張雅芝等, 2009)、行為(陳松波, 2004; Goyer et al, 2014)、生殖(張亞晨,2015)、免疫(Morvan et al, 1996; 何福林等, 2007)等造成影響，從而引起魚類一系列生理生化指標的改變，如虹鱒(Oncorhynchus mykiss)在水溫14℃～23℃下，紅細胞數(shù)量隨溫度的升高而減少(向建國, 2008)；22℃下急性溫度脅迫銀鯧(Pampus argenteus)幼魚48 h，其胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力無顯著變化(P＞0.05)，而二者在 32℃下的活力顯著上升(P＜0.05) (施兆鴻等,2016)。熱休克蛋白70 (Heat Shock Protein 70, HSP70)是魚類溫度應激中最重要的生理生化指標之一。

HSP70 是熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)家族中最為重要的一員，分子量約為70 kDa。遺傳學家Ritossa 首次在果蠅(Drosophila)唾液腺中發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白(Ritossa, 1962)；除熱休克外，細胞在低溫、缺氧、重金屬、營養(yǎng)缺乏等其他應激條件下，也有HSPs生成，因此，又被稱為應激蛋白(Stress Protein, SP) (鐘文英等, 2005)。HSP70 是目前魚類中研究最廣泛的一類熱休克蛋白，許多魚類的hsp70 基因序列已報道，如羅非魚(Oreochromis mossambicus) (Molina et al,2000)、草魚(Ctenopharyngodon idella) (林亞秋等,2009)、團頭魴(Megalobrama amblycephala) (明建華等,2009)、達氏鰉(Huso dauricus)(Peng et al, 2016)等。HSP70 具有重要的生物學功能，如分子伴侶功能、保護遺傳物質DNA、增強細胞耐受能力等。作為分子伴侶，在高溫下，HSP70 能協(xié)助變性蛋白復性(Heredia,2008)、保護生物體免受損傷(Deane et al, 2006; Rosic et al, 2011)。

雜交黃顙魚(黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco ♀ ×瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli ♂)“黃優(yōu)1 號”是由華中農(nóng)業(yè)大學等多家育種單位共同研發(fā)、經(jīng)全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定通過的我國淡水養(yǎng)殖魚類新品種(品種登記號GS-02-001-2018)，其在相同養(yǎng)殖條件下，與母本黃顙魚相比，1 齡魚生長速度平均提高143.4%；與父本瓦氏黃顙魚相比，品質和市場接受度提高。目前，盡管在國內(nèi)已開展關于雜交黃顙魚雜交育種及雜種鑒定等初步研究工作(王衛(wèi)民, 2003;唐忠林等, 2016; 鞏高瑞等, 2017; 張佳佳等, 2017)，但在抗逆方面的研究相對較少。本研究對雜交黃顙魚hsp70 基因進行克隆、生物信息學分析、組織表達的同時，探究了溫度應激對hsp70 基因組織表達的影響，為其抗逆、抗病選育奠定理論基礎，也為其健康高效養(yǎng)殖提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

選取健康無病、規(guī)格整齊的雜交黃顙魚30 尾，體長為(13.88±1.03) cm，采集于四川省眉山市東坡區(qū)緣通特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場。

30 尾魚隨機分為4 組，每組6 尾，4 組魚均暫養(yǎng)于48 cm×34 cm×25 cm 的養(yǎng)殖箱中，水深20 cm。設置4 個溫度梯度，分別為20℃(常溫組)、25℃、28℃和31℃，采用控溫器控溫(±0.5℃)，處理3 h 后麻醉，迅速取各組的肝臟、鰓、腦和肌肉，液氮速凍，–80℃超低溫冰箱保存。

1.2 hsp70 基因核心序列的克隆

參照Total RNA Kit Ⅱ(Omega)提取雜交黃顙魚總 RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳和 NanoDrop 2000(Thermo)檢測 RNA 的完整性、濃度和純度。參照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的步驟進行cDNA 的合成。

根據(jù)GenBank 中黃顙魚的hsp70 cDNA 序列(登錄號：KR673401.1)，設計引物(表1)擴增雜交黃顙魚hsp70 基因核心序列。以雜交黃顙魚cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 體系參照2×TSINGKE?Master Mix(TSINGKE)。回收與純化、測序，獲得雜交黃顙魚hsp70 基因核心序列。

表1 本實驗所用的引物序列Tab.1 The primers used in the experiment

1.3 hsp70 基因組織表達

根據(jù)雜交黃顙魚hsp70 的核心序列，設計qPCR引物(表1)。參照黃顙魚組織表達相關研究(馮美惠等,2017; 張娟等, 2009)，獲取內(nèi)參基因β-actin 和18S rRNA 序列設計內(nèi)參引物(表1)。提取雜交黃顙魚肝臟、鰓、腦、肌肉的總RNA，反轉錄，采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)方法檢測hsp70 基因mRNA 在肝臟、鰓、腦、肌肉中的相對表達量，計算方法為2–ΔΔCt(Livak et al, 2001)。

采用SPSS 22.0 進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，不同處理間進行Duncan’s 多重比較檢驗，顯著水平取0.05。

2 結果

2.1 hsp70 基因核心序列分析

測序結果表明，從雜交黃顙魚肝臟組織分離鑒定得到的hsp70基因片段大小為735 bp(圖1)，通過NCBI上 的 ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)，ORF為729 bp，翻譯得到編碼243個氨基酸的蛋白質；于ExPASy-Protparam tool (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)進行蛋白序列基本特征分析：氨基酸組成中，Leu(L)、Ala(A)和Ser(S)含量較高，分別為8.6%、8.6%和7.8%；酸性氨基酸(Asp+Glu) 27個，占11.1%；堿性氨基酸(Arg+Lys) 32個，占13.2%；其理論pI/MW為9.06/27251.28。

圖1 雜交黃顙魚hsp70 基因核心序列及推測的氨基酸序列Fig.1 Core cDNA and deduced amino acid sequences of hsp70 in the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂

2.2 hsp70 基因核苷酸與氨基酸同源性分析

將克隆得到的雜交黃顙魚hsp70 基因核苷酸與氨基酸序列分別于NCBI 上的 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行Nucleotide BLAST 和Protein BLAST。運用MegAlign 7.0 進行核苷酸與氨基酸同源性分析。結果顯示(表2)，雜交黃顙魚與6 種魚類的 hsp70 基因核苷酸同源性為 80.2%～99.7%，氨基酸同源性為87.6%～99.6%，表明hsp70基因有較高同源性，該區(qū)段在進化中高度保守。圖2詳細列出了雜交黃顙魚與以上6 種魚類的hsp70 基因氨基酸序列的差異。

表2 雜交黃顙魚hsp70 基因核苷酸與氨基酸同源性分析Tab.2 Homology analysis of nucleotide and amino acid sequences of hsp70 gene in the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂(%)

圖2 hsp70 基因氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences of hsp70 gene

2.3 hsp70 基因組織表達

以β-actin 和18S rRNA 為雙內(nèi)參基因，qPCR 分析hsp70 基因在20℃(常溫組)雜交黃顙魚不同組織中的相對表達量。結果顯示(圖3)，hsp70 基因在雜交黃顙魚肝臟、鰓、腦、肌肉4 個組織均有表達，其表達量由高到低依次為肝臟、腦、鰓、肌肉。肝臟與腦、鰓、肌肉的表達量均差異顯著(P＜0.05)，腦與鰓、肌肉的表達量差異顯著(P＜0.05)，鰓與肌肉的表達量差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 雜交黃顙魚hsp70 基因在不同組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression of hsp70 gene in different tissues of the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂

2.4 hsp70 基因在溫度應激下組織表達分析

溫度應激實驗qPCR 結果顯示(圖4)，25℃、28℃和31℃下，hsp70 基因的表達量由高到低依次均為鰓、肝臟、腦、肌肉，且28℃、31℃下hsp70 基因于鰓中的表達量與肝臟、腦、肌肉中的表達量差異顯著(P＜0.05)；而25℃下，hsp70 基因于鰓中的表達量與肝臟中的表達量差異不顯著(P＞0.05)，但與腦、肌肉中的表達量差異顯著(P＜0.05)。

肝臟中hsp70 基因的表達量隨溫度的升高先上升后下降，28℃時達到最大值，表達量顯著高于20℃、25℃和31℃下的表達量(P＜0.05)；鰓中，hsp70 基因的表達量隨溫度的升高而不斷上升，31℃時達到最大值，28℃和31℃下的表達量顯著高于20℃和25℃下的表達量(P＜0.05)，說明溫度應激對雜交黃顙魚hsp70基因在鰓中的表達量影響大；腦中，hsp70 基因的表達量隨溫度的升高先上升后下降，28℃時達到最大值，且28℃下的表達量與20℃、25℃和31℃下的表達量差異顯著(P＜0.05)；肌肉組織中，hsp70 基因的表達量隨溫度的升高逐漸上升，31℃時達到最大值，31℃下的表達量與20℃、25℃和28℃下的表達量差異顯著(P＜0.05)。

圖4 不同溫度下雜交黃顙魚hsp70 基因在不同組織中的相對表達量Fig.4 Relative expression of hsp70 gene in different tissues of the hybrid of P. fulvidraco ♀ × P. vachelli ♂at different temperatures

3 討論

魚類是變溫脊椎動物，溫度的日變化和季節(jié)變化對魚的生命過程有重要影響，水環(huán)境的其他因素(如重金屬、缺氧、細菌感染等)也影響著魚類的分布和生理狀態(tài)，而這些因素與它們體內(nèi)熱休克蛋白的數(shù)量和表達程度息息相關。HSPs 在生物界普遍存在，在同一生物體的不同組織內(nèi)均有表達(曲凌云等, 2004)。本研究通過qPCR 的方法檢測了hsp70 在雜交黃顙魚不同組織中的相對表達量，結果表明(圖3)，hsp70基因在肝臟、鰓、腦、肌肉具有明顯的組織特異性，肝臟中的表達量顯著高于腦、鰓、肌肉中的表達量，這可能與肝臟在動物消化、代謝、免疫、內(nèi)環(huán)境的調節(jié)等方面都具有十分重要的作用有關。hsp70 的組織特異性表達在草魚(林亞秋等, 2009)、淞江鱸(Trachidermus fasciatus) (劉慶全, 2013)、達氏鰉(Peng et al, 2016)中均有報道，但相對表達量和組織間表達水平存在差異：如草魚的各組織間的表達量由高到低依次為腦、肝胰臟、鰓、肌肉，且腦與肝胰臟、鰓、肌肉的表達量差異顯著(P＜0.05) (林亞秋等, 2009)；淞江鱸hsp70 基因在鰓、腦、肌肉、肝臟中的表達量依次遞減(劉慶全, 2013)?？赡茉蛴形锓N的差異性及實驗溫度設置的不同，溫度變化對hsp70 在不同的組織中會產(chǎn)生不同的響應(Peng et al, 2016; 王云彪,2008; 萬文菊, 2006)。

溫度應激實驗研究不同溫度下雜交黃顙魚hsp70基因在不同組織中的表達水平。20℃～31℃，隨著溫度的升高，hsp70 基因在不同組織中均呈先上升趨勢，表明hsp70 基因在保護機體免受損害中發(fā)揮作用，其中，鰓和肌肉中的表達量呈持續(xù)上升的趨勢；而在肝臟和腦中的表達量呈先上升后下降的趨勢，28℃到達峰值。鰓、肌肉和肝臟中的變化趨勢與草魚hsp70 對溫度響應的變化(周鑫等, 2013)趨勢一致。腦中的變化趨勢與鯉魚(Cyprinus carpio)的應激實驗中10℃～28℃的變化趨勢(王云彪, 2008)一致，均呈不斷上升的趨勢。此外，西伯利亞鱘(Acipenser baerii)進行急性熱應激，魚體從17.5℃迅速轉至27.5℃后，hsp70 于鰓和腦中的表達量均呈上升趨勢(田照輝等, 2013)，這也與本研究結果相符。

hsp70 具有廣泛的運用前景，可作為生物指標診斷魚類的生理狀態(tài)(Dunlap et al, 1997; Vijayan et al,1997)、生物標記物與水環(huán)境監(jiān)測(De, 1996; 沈驊等,2004)，而作為生物標志物在生理學上的合理性即是基于HSP70 家族的誘導模式，即細胞內(nèi)HSP70 表達水平可作為機體“溫度計”的功能(Ge et al, 2002)。HSP70 對溫度極為敏感，已被用作分子標記分析生物對溫度等環(huán)境變化的響應(Mukhopadhyay et al,2010)。研究表明，急性溫度應激會顯著改變尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚肝臟HSP70 的表達，其表達量基本呈先上升后下降的趨勢(強俊等, 2012)；而銀鯽(Carassius auratus gibelio)熱應激2 h 后，肝臟中hsp70 表達量達到最高(P＜0.01) (周朝偉, 2018)。hsp70 在不同組織對溫度應激的響應不同，本研究中，雜交黃顙魚的鰓組織對溫度的響應最為敏感，鰓為雜交黃顙魚溫度應激的敏感組織，可能是鰓作為魚類呼吸代謝的重要器官，hsp70 表達量升高是魚類在溫度急劇變化情況下的一種機體保護策略。hsp70 基因家族存在亞型 hsc70 基因，目前國內(nèi)有開展黃顙魚HSC70 表達(張娟, 2009)的相關研究，25℃下HSC70在所檢測的組織中均有表達，且表達量在鰓中最高，在肌肉中最低，這與雜交黃顙魚在25℃下HSP70 的組織表達結果一致，進一步表明HSP70 基因家族對黃顙魚的鰓在溫度應激下產(chǎn)生的免疫應答對機體保護具有重要作用。

研究表明，氧限制的熱耐受性理論(Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance, OCLTT) (P?rtner et al,2001、2008)可適用于淡水廣溫性魚類(周鑫等, 2013)，根據(jù)該理論：當環(huán)境溫度超過生物體最適溫度時，有氧代謝會下降，隨著溫度進一步上升，將導致有氧代謝喪失，轉變?yōu)闊o氧代謝，氧自由基和變性蛋白相應增加，影響免疫應答及誘導熱休克蛋白的表達。由于熱休克蛋白的表達需要消耗能量，其只能提供短期保護(P?rtner et al, 2001、2007)。基于hsp70 的表達量，后期可開展雜交黃顙魚耗氧率和半致死溫度的實驗，以確定雜交黃顙魚的生理臨界溫度。這將為雜交黃顙魚抗逆、抗病選育奠定理論基礎，也為其健康高效養(yǎng)殖提供理論指導。

致謝：感謝四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院杜小剛副教授和李云坤博士研究生，感謝四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院銀龍碩士、張月碩士、張松培碩士和苗懿碩士研究生，感謝四川大學生命科學學院黎樹博士研究生及眉山偉繼水產(chǎn)種業(yè)科技有限公司張繼業(yè)總經(jīng)理等在實驗過程中給予的指導和幫助！