林鍵章 王文磊 徐 燕 許 凱 紀(jì)德華 陳昌生 謝潮添

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康與養(yǎng)殖重點實驗室 福建省水產(chǎn)生物育種與健康養(yǎng)殖工程研究中心集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門 361021)

紫菜是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價值、營養(yǎng)價值和生態(tài)價值的大型海藻，不僅可以食用，還被廣泛用作肥料、藥物和化學(xué)物質(zhì)的來源(Blouin et al, 2011)，而且作為“藍(lán)碳”物種和生物燃料，具有巨大的潛力(Nellemann et al, 2009; Xu et al, 2016)。經(jīng)估算，大型海藻每年可固定約173 Tg 的碳，并作為碳供體將90%固定的碳輸送至深海，其余則埋藏在沿海沉積物中，該估算值超過沿海生境中被子植物的碳埋藏估值(Krause-Jensen et al, 2016、2018)，表明大型海藻在固碳方面有著巨大潛力。此外，由于紫菜等大型海藻含有較高的結(jié)構(gòu)多糖和低木質(zhì)素、不占用耕地等原因，其為生物燃料的優(yōu)質(zhì)原料(Ghadiryanfar et al, 2016; Sudhakar et al,2018)。Duarte 等(2017)指出，養(yǎng)殖海藻全部用于生物燃料生產(chǎn)，每平方千米養(yǎng)殖海藻每年可減少1500 t CO2排放。2018 年，我國栽培紫菜產(chǎn)量超過201779 t(干重)，占養(yǎng)殖海藻產(chǎn)量的8.6%，其中，以壇紫菜(Pyropia haitanensis)為主要栽培對象的福建省紫菜產(chǎn)量已超過 74628 t (干重)(中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒,2019)，帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

然而，近年來，隨著全球氣候變暖，溫度成為限制紫菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素(陳偉洲等, 2015; Wang et al, 2018)。盡管一些壇紫菜耐高溫品系(Z-26、Z-61和 ZS-1)已廣泛栽培(Chen et al, 2008; Yan et al,2010)，但有關(guān)壇紫菜的耐高溫機制仍然知之甚少。因此，闡明壇紫菜的耐高溫機制對耐高溫品系的選育具有重要意義。目前，對于壇紫菜耐高溫機制的研究主要集中在比較組學(xué)分析，例如，Wang 等(2018)比較了Z-61 和野生型壇紫菜的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)Z-61 可以通過更為積極的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抵御高溫環(huán)境。Shi 等(2017)使用iTRAQ 技術(shù)在壇紫菜中鑒定了151 種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，其中，參與清除未折疊蛋白或變性蛋白的泛素蛋白酶體系統(tǒng)在壇紫菜應(yīng)答高溫脅迫過程中顯著上調(diào)表達(dá)，但其具體功能有待進(jìn)一步驗證。

泛素蛋白酶體系統(tǒng)是最重要的脅迫響應(yīng)系統(tǒng)之一，通過降解受損或多余的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞中蛋白質(zhì)的平衡。泛素化過程由3 種酶介導(dǎo)：E1(泛素激活酶，UBA)；E2(泛素結(jié)合酶，UBC)；E3(泛素連接酶)(Zhang et al, 2015)。其中，E3 連接酶識別配體蛋白并決定蛋白質(zhì)降解的高特異性，因此，在泛素化過程中起關(guān)鍵作用。許多研究表明，E3 是植物響應(yīng)非生物脅迫的“調(diào)節(jié)劑”，甚至單個E3 可以調(diào)節(jié)植物響應(yīng)多重非生物脅迫(Moin et al, 2019)。Cullin-RING 連接酶是真核生物中被廣泛研究的多亞基E3 連接酶，在植物中有3 種類型：CUL1、CUL3a/b 和CUL4 (Stone,2014)。CUL3 可以促進(jìn)DREB2A 的降解來提高擬南芥(Arabidopsis)的耐熱性(Morimoto et al, 2017)。此外，水稻Cullin 家族基因在應(yīng)對非生物脅迫時呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(Moin et al, 2019)。以上結(jié)果說明，Cullin E3 連接酶可能在植物響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，壇紫菜的CUL1 基因也積極響應(yīng)高溫脅迫(Wang et al, 2018)，但其具體功能有待進(jìn)一步實驗驗證。

由于壇紫菜的特殊結(jié)構(gòu)及缺乏啟動子和轉(zhuǎn)化方法等問題，目前尚未在壇紫菜中建立一套穩(wěn)定的遺傳操作體系，對這些候選基因和蛋白的功能還不明確。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作為一種真核單細(xì)胞綠藻，被廣泛用于驗證基因的功能和基本的生物學(xué)進(jìn)程。同時，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，已開發(fā)出一些可應(yīng)用于萊茵衣藻的遺傳操作技術(shù)，包括核轉(zhuǎn)化、葉綠體和線粒體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Dejtisakdi et al, 2016)。到目前為止，許多異源基因已在萊茵衣藻中成功表達(dá)，包括微藻Chlorella zofingiensis (Cordero et al,2011)和大型海藻Porphyra seriata (Kim et al, 2011)。Jin 等(2017)成功將甘紫菜(Pyropia tenera)HSP19.3 轉(zhuǎn)入萊茵衣藻，并證實了其在耐熱方面的作用。以上結(jié)果表明，萊茵衣藻可能是表達(dá)壇紫菜基因的良好載體。因此，本研究將壇紫菜的PhCUL1 基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻進(jìn)行耐熱性分析，探究壇紫菜泛素連接酶(PhCUL1)在抗高溫中的作用，為壇紫菜耐高溫品系的選育提供基因信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料培養(yǎng)

本實驗所選用的壇紫菜耐高溫品系Z-61 由集美大學(xué)壇紫菜種質(zhì)改良和應(yīng)用實驗室選育和純化。培養(yǎng)條件：溫度(21±1)℃，光照強度50～60 μmol/(m2?s)，光周期12 L∶12 D，每2 d 更換1 次新鮮的Provasoli's enrichment solution (PES)培養(yǎng)液，并充氣培養(yǎng)。培養(yǎng)藻體長度至15 cm 左右時，選取表面光滑、無破損、無扭曲的健康藻體進(jìn)行后續(xù)實驗。

萊茵衣藻細(xì)胞壁缺失株系“CC-400 cw15 mt+”被用于PhCUL1 轉(zhuǎn)基因功能驗證。萊茵衣藻細(xì)胞在Trisacetate-phosphate (TAP)培養(yǎng)液中培養(yǎng)：溫度25℃，光照強度50 μmol/(m2?s)，光周期14 L∶10 D。每隔2 h 輕搖1 次培養(yǎng)液，防止細(xì)胞貼壁生長。

1.2 總RNA 的分離純化和cDNA 的合成

采用E.Z.N.A 植物RNA 提取試劑盒(OMEGA，德國)提取壇紫菜和萊茵衣藻的總RNA。使用1%凝膠電泳檢測所提取總RNA 的完整性，并在紫外分光光度計上分別測定OD260nm和OD280nm值，計算出RNA的濃度，判斷其純度。

用于實時熒光定量PCR 分析的cDNA 用PrimeScript RT reagent kit (TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA 稀釋10 倍備用。

1.3 壇紫菜PhCUL1 基因的全長克隆

根據(jù)壇紫菜轉(zhuǎn)錄組的注釋結(jié)果，篩選出一條注釋結(jié)果為臍形紫菜(Porphyra umbilicalis) CUL1 的Unigene0010232。根據(jù)序列設(shè)計1 對擴(kuò)全長引物(正向引物加KpnⅠ酶切位點序列，反向引物加XbaⅠ酶切位點序列，便于后續(xù)實驗) PhCUL1F 和PhCUL1R(表1)，PCR 擴(kuò)增PhCUL1 基因的保守序列，預(yù)期長度為2481 bp；擴(kuò)增體系為25 μl：2×Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl，每條引物0.5 μl，cDNA 模板2 μl。PCR擴(kuò)增程序：95℃變性5 min；95℃ 40 s；62℃ 30 s；72℃ 2 min 30 s，35 個循環(huán)；72℃，延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收、轉(zhuǎn)化和測序，驗證全長克隆的正確性。

表1 實驗用到的引物名稱和序列Tab.1 Primers and sequences used in this experiment

1.4 PhCUL1 基因的生物信息學(xué)分析

使用在線軟件NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)分析PhCUL1 基因核苷酸序列，推導(dǎo)氨基酸序列和開放閱讀框(ORF)。通過 SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)來識別保守結(jié)構(gòu)域。使用MEGA6 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建PhCUL1 系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 PhCUL1 衣藻表達(dá)載體構(gòu)建

使用KpnⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶雙酶切目的基因和衣藻表達(dá)載體V3，載體圖譜見圖1。酶切體系：目的基因2 μg，10×M 緩沖液3 μl，KpnⅠ內(nèi)切酶1 μl，XbaⅠ內(nèi)切酶1 μl，用ddH2O 補足體系。V3 載體1 μg，10×M 緩沖液2 μl，KpnⅠ內(nèi)切酶1 μl，XbaⅠ內(nèi)切酶1 μl，用ddH2O 補足體系。酶切程序：37℃，140 min，65℃，10 min。將酶切后的基因和V3 載體16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化和涂板。挑取陽性菌落進(jìn)行PCR 驗證，獲得含有目的基因的V3 衣藻表達(dá)載體。

1.6 萊茵衣藻核轉(zhuǎn)化

萊茵衣藻核轉(zhuǎn)化采用“玻璃珠轉(zhuǎn)化法”。萊茵衣藻“CC-400 cw15 mt+”在TAP 培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(細(xì)胞數(shù)約為2×106個)，室溫6000 r/min 離心5 min，棄上清液，倒置1 min。用300 μl TAP 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，加入到含300 mg 滅菌并烘干的玻璃珠的2 ml 離心管中，再加入0.1 ml 20% PEG 6000，2 μg 線性重組載體，5 μl 鮭魚精DNA。置于漩渦振蕩器上震蕩30 s，停歇30 s，重復(fù)2 次。把混合液加入到40 ml新鮮TAP 培養(yǎng)液，在100 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。室溫6000 r/min 收集細(xì)胞，去上清液，用400 μl TAP 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，混勻后倒在TAP 平板上(含10 μg/ml 潮霉素B)，24℃光照培養(yǎng)7～10 d，平板上長出單個克隆藻。

圖1 衣藻表達(dá)載體V3 圖譜Fig.1 V3 expression vector of C. reinhardtii

1.7 PhCUL1 基因表達(dá)水平的qPCR 分析

根據(jù)PhCUL1 的序列，設(shè)計qPCR 正反向引物，并以 β-tubulin 基因作為內(nèi)參(表 1)，進(jìn)行高溫下PhCUL1 在萊茵衣藻中的表達(dá)水平分析。20 μl 體系：10 μl 2×SYBR green Master Mix(TaKaRa, 日本)，0.4 μl正反向引物(20 mmol/L)，2 μl 稀釋模板，0.4 μl ROX Dye 和6.8 μl ddH2O。擴(kuò)增程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40 個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，檢查擴(kuò)增的熔解曲線，確保擴(kuò)增的特異性。熒光定量PCR 擴(kuò)增在ABI7300 型定量PCR 儀(Applied Biosystems, 美國)上進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均設(shè)置3 個重復(fù)。利用Excel 和SPSS 17.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，P＜0.05 表示存在顯著差異，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 PhCUL1 基因的克隆及序列分析

以壇紫菜cDNA 為模板，PhCUL1F/PhCUL1R 為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1 條擴(kuò)增條帶，長度約為2500 bp(圖 2a)。通過 BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，其與 Porphyra umbilicalis (GenBank No.: OSX79849.1)的cullin-1 基因核酸序列同源性達(dá)到85.14%，進(jìn)而推斷該片段為PhCUL1 的基因片段。

圖2 PhCUL1 基因克隆產(chǎn)物凝膠電泳和保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Agarose electrophoresis of PCR products of PhCUL1 gene and protein domain analysis of PhCUL1

通過ORF Finder 軟件分析發(fā)現(xiàn)，PhCUL1 基因的ORF 為2481 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼827 個氨基酸，預(yù)測分子量為91.34 kDa，理論等電點為6.43。通過SMART 分析其保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)PhCUL1 存在1 個Cullin (407～618 aa) 結(jié)構(gòu)域和1 個Cullin Nedd8 (754～821 aa)結(jié)構(gòu)域(圖2b)。

2.2 PhCUL1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了確定PhCUL1 的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建了PhCUL1 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖 3)，PhCUL1 與紅藻門角叉菜(Chondrus crispus)、龍須菜(Gracilariopsis chorda)和臍形紫菜(Porphyra umbilicalis)聚為一側(cè)，而與高等植物明顯區(qū)分開來，這說明PhCUL1 基因在紅藻門中較為保守。而在紅藻門中，PhCUL1 與臍形紫菜聚為一支，這說明PhCUL1 基因在紫菜中較為保守。

2.3 PhCUL1 基因在高溫脅迫下的差異表達(dá)變化

圖3 采用NJ 法構(gòu)建的基于PhCUL1 基因所編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on PhCUL1 amino acid sequences by NJ method

為了研究壇紫菜PhCUL1 對高溫脅迫的響應(yīng)，本研究采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測PhCUL1 基因在高溫31℃處理不同時間水平(0、3、6、12 和24 h)下的相對表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示(圖4)，高溫對PhCUL1基因表達(dá)水平有顯著影響，高溫處理3 h，PhCUL1的表達(dá)量是0 h 的11 倍；高溫處理6 h 和12 h，表達(dá)水平較之于高溫處理3 h 有所下降，但顯著高于0 h，其表達(dá)量分別是0 h 的5.1 倍和8.0 倍。高溫處理24 h后，PhCUL1 的表達(dá)量達(dá)到最高值，是0 h 的16.9 倍。

圖4 壇紫菜PhCUL1 基因在高溫31℃脅迫過程中相對表達(dá)變化Fig.4 The relative expression of PhCUL1 gene in P. haitanensis under 31℃ treatment

2.4 轉(zhuǎn)PhCUL1 萊茵衣藻陽性克隆子的篩選

隨機挑選8 個潮霉素B 抗性品系的衣藻，提取DNA，使用PhCUL1 特異引物(表1)進(jìn)行PCR 驗證。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所有挑選出的衣藻都檢測到陽性PCR 產(chǎn)物，但在野生型品系中未發(fā)現(xiàn)陽性克隆，表明PhCUL1 基因已成功轉(zhuǎn)入衣藻基因組(圖5)。選擇第4 個轉(zhuǎn)基因品系(T4)進(jìn)行后續(xù)功能分析。

2.5 轉(zhuǎn)PhCUL1 衣藻對高溫脅迫的耐受性分析

為了研究轉(zhuǎn)基因衣藻對高溫脅迫的耐受程度，在33℃下培養(yǎng)野生型和轉(zhuǎn)基因衣藻36 h，每天觀察其生物量(圖6)，并測定其在750 nm 的吸光度(表2)。結(jié)果顯示，高溫33℃脅迫12 h 后，轉(zhuǎn)基因衣藻(T4)的生物量高于野生型衣藻(WT)。高溫33℃脅迫36 h 后，轉(zhuǎn)基因衣藻(T4)的生物量明顯高于野生型衣藻(WT)。相應(yīng)的OD750nm也與此結(jié)果吻合(表2)。

圖6 高溫33℃脅迫下衣藻的生物量變化Fig.6 Biomass of C.reinhardtii under 33℃ treatment

表2 高溫33℃脅迫下衣藻濃度的變化Tab.2 Concentration of C. reinhardtii under 33℃ heat stress

2.6 PhCUL1 基因在萊茵衣藻中的差異表達(dá)變化

高溫33℃脅迫1～6 h 后，PhCUL1 基因的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)(圖7)，且在脅迫3 h 時，基因的表達(dá)水平最高，約為對照組的3 倍。脅迫9 h后，PhCUL1 表達(dá)水平下降，與對照組無顯著差異。

圖7 高溫33℃脅迫下PhCUL1 基因在萊茵衣藻中的相對表達(dá)水平Fig.7 The relative expression level of PhCUL1 gene in C. reinhardtii under 33℃ treatment

3 討論

溫度是影響紫菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個主要因素。近年來，頻繁出現(xiàn)的秋季高溫回暖天氣嚴(yán)重影響了壇紫菜栽培工作的有序開展，水溫過高導(dǎo)致壇紫菜幼苗或成菜發(fā)生病爛，造成嚴(yán)重減產(chǎn)(陳玉婷等, 2015)。進(jìn)一步研究壇紫菜的耐高溫機理對于快速選育耐高溫品系具有重要的理論意義。前期研究已證實，泛素系統(tǒng)在響應(yīng)高溫、高鹽和干旱等非生物脅迫中扮演著重要角色(Zhang et al, 2015)。其中，E3 連接酶因其決定靶蛋白的特異性而被廣泛研究。Cullin-RING E3 連接酶是真核生物中一個被充分研究的基因家族，Cullin 蛋白一般含有1～3 個結(jié)構(gòu)域(Moin et al, 2019)。本研究克隆獲得的壇紫菜PhCUL1 基因含有2 個保守結(jié)構(gòu)域，407～618 位點是cullin 結(jié)構(gòu)域，754～821 位點是Cullin Nedd8 結(jié)構(gòu)域。其中，Nedd8 結(jié)構(gòu)域是蛋白融合位點，它能賦予cullin E3 泛素連接酶活性(Hori et al,1999)，表明PhCUL1 也可能具有泛素連接酶活性，Nedd8 是PhCUL1 介導(dǎo)泛素連接酶活性的體現(xiàn)。

已有大量文獻(xiàn)報道和證據(jù)表明，cullin 家族基因可以積極響應(yīng)非生物脅迫。例如，Moin 等(2019)在研究水稻的逆境脅迫表達(dá)譜時發(fā)現(xiàn)，水稻cullin 家族基因在多種逆境脅迫下上調(diào)表達(dá)。本研究也分析了壇紫菜PhCUL1 基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式。研究結(jié)果顯示，在高溫31℃脅迫下，PhCUL1 基因在不同時間點均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢；高溫脅迫 3 h 時，PhCUL1 基因的表達(dá)量是0 h 的11 倍，說明PhCUL1基因?qū)Ω邷孛{迫反應(yīng)非常迅速，短時間內(nèi)可以大量積累表達(dá)；隨著脅迫時間的延長，PhCUL1 基因的表達(dá)量有所下調(diào)，但仍然高于0 h，高溫脅迫6 h 和12 h的PhCUL1 基因表達(dá)量分別是0 h 的5.1 倍和8.0 倍；當(dāng)脅迫時間持續(xù)到24 h 時，PhCUL1 仍然處于高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)量是0 h 的16.9 倍。以上結(jié)果表明，PhCUL1 在高溫脅迫過程中均上調(diào)表達(dá)，可能是壇紫菜響應(yīng)高溫脅迫的一個關(guān)鍵基因，但具體功能需進(jìn)一步驗證。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，許多研究人員利用遺傳操作手段對E3 連接酶的功能進(jìn)行了驗證。Peng 等(2019)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)擬南芥E3 連接酶AtPUB48 可以增強擬南芥種子發(fā)芽和幼苗生長階段的耐熱性。此外，過表達(dá)水稻E3 連接酶OsHIRP1 使水稻在高溫下具有比對照組更高的萌發(fā)率(Kim et al, 2019)。然而，有關(guān)E3 連接酶基因在大型海藻抗逆過程中發(fā)揮的具體功能尚未發(fā)現(xiàn)報道。本研究在萊茵衣藻中轉(zhuǎn)入PhCUL1 基因來研究其耐熱功能。qRT-PCR 結(jié)果顯示，高溫33℃脅迫下轉(zhuǎn)基因衣藻的PhCUL1 基因顯著上調(diào)表達(dá)，表明該基因能被高溫脅迫誘導(dǎo)。生理實驗結(jié)果顯示，在持續(xù)的高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因衣藻比野生型具有更高的存活率，證明PhCUL1 基因可能通過維持蛋白穩(wěn)態(tài)調(diào)控了壇紫菜的耐熱過程。當(dāng)然，一個機體對非生物脅迫的調(diào)控機制是非常復(fù)雜的，至于PhCUL1 基因是如何在這個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中起作用，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了壇紫菜的泛素連接酶PhCUL1基因，而且該基因被高溫顯著誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)入PhCUL1 基因的萊茵衣藻也比野生型衣藻具有更強的耐熱性，證明了PhCUL1 基因的耐熱功能。這為壇紫菜耐高溫機制的解析提供了有用的基因信息，也為耐高溫品系的培育奠定了理論基礎(chǔ)。