鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃抗氧化酶和血清皮質(zhì)醇的影響*

張宇婷 楊 建 耿龍武 王 雨 姜海峰 徐 偉①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所哈爾濱 150070；3. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種植資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306)

鹽度是影響魚類機(jī)體生理生化狀態(tài)的重要環(huán)境因子之一，對(duì)魚類的生存(嚴(yán)銀龍等, 2019)、生長(zhǎng)發(fā)育(El-Leithy et al, 2019)影響顯著。研究表明，廣鹽性魚類在轉(zhuǎn)入高鹽度水體過(guò)程中，機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，會(huì)消耗大量的能量，同時(shí)產(chǎn)生大量的有害代謝產(chǎn)物，如超氧負(fù)離子自由基、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等(胡靜等, 2015)，而機(jī)體內(nèi)的非特異性免疫酶類，如酸性磷酸酶(Acidic phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)等則在保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化物二次損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；而皮質(zhì)醇則在能量代謝和免疫調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)魚類長(zhǎng)期處于脅迫環(huán)境時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其機(jī)體代謝紊亂、免疫機(jī)能下降，甚至引起魚類的死亡(Li et al, 2017;Hoseini et al, 2019; 齊明, 2014)。

大鱗鲃為鯉科(Cyprinidae)、鲃亞科(Barbinae)、鲃屬(Barbus)魚類(Nikoriski, 1958)。目前，關(guān)于大鱗鲃的鹽度適應(yīng)性研究主要集中在生存(楊建等, 2014)、生長(zhǎng)發(fā)育(黨云飛等, 2013)、滲透調(diào)控(耿龍武等, 2011)等方面。在免疫機(jī)能的影響方面，僅初步檢測(cè)了超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)在肝、腎和鰓組織中的時(shí)空變化(楊建,2014)。為全面揭示鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃機(jī)體免疫應(yīng)激水平的影響，以便為大鱗鲃鹽堿水域的養(yǎng)殖提供更加準(zhǔn)確、有效的參考，本研究檢測(cè)分析不同鹽度脅迫下，大鱗鲃肝、腎和鰓組織中ACP、AKP、GSH-Px 和MDA 等氧化應(yīng)激參數(shù)和血清皮質(zhì)醇水平的變化，以期闡明鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃抗氧化能力和機(jī)體應(yīng)激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。隨機(jī)選300 尾體長(zhǎng)為(25.0±0.5) cm、體重為(95.00±5.56) g 的健康、體型正常的個(gè)體于室內(nèi)暫養(yǎng)3 d，暫養(yǎng)用水為曝氣2 d 的自來(lái)水，水溫為(24.0±1.5)℃。

根據(jù)楊建等(2014)的結(jié)果和鹽度預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)NaCl 鹽度實(shí)驗(yàn)組(3、6、9 和12 g/L)和1 個(gè)淡水對(duì)照組，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行組。實(shí)驗(yàn)溶液采用曝氣2 d 的自來(lái)水和NaCl(國(guó)產(chǎn)，分析純)在體積為200 L 的玻璃缸中進(jìn)行配制，并用鹽度測(cè)量?jī)x(上海三信儀表廠，SX713-02 型)檢測(cè)校準(zhǔn)。溶液配制完成后穩(wěn)定2 d。各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)挑選20 尾大鱗鲃進(jìn)行為期7 d 的耐受實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間水溫為(24.0±1.5)℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與樣品采集

各組分別于實(shí)驗(yàn)開始后3、6、12、24、48、96 h和7 d 進(jìn)行樣品采集，用40 mg/L 的MS-222 在實(shí)驗(yàn)相同鹽度梯度下麻醉，每個(gè)鹽度實(shí)驗(yàn)組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)于3 個(gè)平行組隨機(jī)采集1 尾實(shí)驗(yàn)魚，共采集3 尾。尾部靜脈采集血液樣本，4℃條件下3000 r/min 離心10 min，取上清液，–80℃保存待測(cè)；冰上解剖實(shí)驗(yàn)魚，采集其肝、腎和鰓組織，并用4℃預(yù)冷的生理鹽水潤(rùn)洗，用吸水紙吸干后迅速放入凍存管，液氮保存待測(cè)。

1.3 組織氧化應(yīng)激指標(biāo)和血清皮質(zhì)醇測(cè)定

取0.2 g 肝、腎和鰓組織樣本，按照質(zhì)量與體積比1∶9 加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水，用組織研磨儀(MM400, Retsch) 10000～15000 r/min 研磨成10%組織勻漿。將制備好的10%勻漿4℃條件下2500 r/min 離心10 min，取上清液，用于測(cè)定ACP、AKP、MDA和GSH-PX 等氧化應(yīng)激指標(biāo)，測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

采用酶聯(lián)免疫法ELISA 和Synergy HTX 多功能檢測(cè)儀(Bio Tek)測(cè)定大鱗鲃血清皮質(zhì)醇，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司(Cat.# m1003467-C)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0 與Graphpad prism5 進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。同一時(shí)間點(diǎn)的不同鹽度組進(jìn)行Duncan′s 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓ACP 活力的影響

由圖1 可知，在脅迫初期，相同鹽度脅迫時(shí)間，3 種組織中ACP 的活力均隨著鹽度的升高而升高；而在相同鹽度條件下，大鱗鲃的肝、腎和鰓中的ACP活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。肝、腎和鰓中ACP 活力分別在脅迫12、6 和24 h 達(dá)到峰值，之后逐步下降并趨于穩(wěn)定；而淡水對(duì)照組3 種組織中ACP 活力的變化范圍分別為1.27～1.42、1.46～1.62 和0.98～1.17 U/g prot，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶活力變化不大。此外，腎中ACP 活力顯著高于肝和鰓，其在肝、腎和鰓組織中的活力范圍分別為1.27～1.96、1.42～2.15 和0.98～1.96 U/g prot。

2.2 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓AKP 活力的影響

圖1 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓組織的ACP 活力的影響Fig.1 Effects of salinity stress on ACP activity in liver,kidney and gill of L. capito

由圖2 可知，在鹽度脅迫初期，在相同脅迫時(shí)間下，肝、腎和鰓組織中AKP 活力隨著鹽度的升高顯著升高(P＜0.05)；而在同一鹽度脅迫下，大鱗鲃3 種組織中的AKP 活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)亦呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。肝和腎組織中AKP 活力在12 h 時(shí)最大，而鰓組織則在24 h 出現(xiàn)峰值；肝和腎組織自24 h 開始下降并趨于平穩(wěn)，而鰓組織在48 h時(shí)下降后趨于平穩(wěn)。淡水對(duì)照組3 種組織中AKP 的活力范圍分別為0.32～0.37、1.03～1.23 和0.98～1.17金氏單位/g prot，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中AKP 活力變化不顯著(P＞0.05)。AKP 活力在腎組織中顯著高于其他2種組織，其在肝、腎和鰓組織中的變化范圍分別為0.31～0.86、1.01～1.87 和0.13～0.84 金氏單位/g prot。

2.3 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓GSH-Px 活力的影響

圖2 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓組織的AKP 活力影響Fig.2 Effects of salinity stress on AKP activity in liver,kidney and gill of L. capito

由圖3 可知，初期相同脅迫時(shí)間下，肝、腎、鰓組織的GSH-Px 活力隨鹽度的升高而升高；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大鱗鲃3 種組織中的GSH-Px 活力在相同鹽度脅迫下呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。肝和腎組織中GSH-Px 的活力在脅迫24 h 達(dá)到峰值，鰓組織則在脅迫6 h 達(dá)到頂峰；腎和鰓組織均在96 h 時(shí)趨于平穩(wěn)，肝組織則在7 d 時(shí)趨于穩(wěn)定；淡水對(duì)照組3 種組織中GSH-Px 活力的變化范圍分別為44.41～46.68、17.19～21.59 和9.07～13.18 活力單位，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中變化差異不大。此外，肝組織的GSH-Px 活力顯著高于腎和鰓組織，GSH-Px 在肝、腎和鰓組織中的活力范圍分別為 44.41～114.77、16.25～67.59 和9.07～48.00 活力單位。

圖3 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓組織GSH-Px 活力的影響Fig.3 Effects of salinity stress on GSH-Px activity in liver,kidney and gill of L. capito

2.4 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓組織中MDA 含量的影響

由圖4 可知，脅迫初期相同時(shí)間點(diǎn)，大鱗鲃肝、腎和鰓的 MDA 含量亦隨鹽度的升高而顯著升高(P＜0.05)；大鱗鲃的肝、腎和鰓中的MDA 含量在相同鹽度條件下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先上升后下降，并趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。其中，3 種組織中MDA含量均在脅迫24 h 時(shí)達(dá)到峰值，腎組織在96 h 時(shí)MDA 含量趨于穩(wěn)定，肝組織則在7 d 時(shí)達(dá)到新穩(wěn)態(tài)，鰓組織在7 d 內(nèi)仍未恢復(fù)正常水平。淡水對(duì)照組3 種組織中MDA 含量分別為18.63～22.55、13.05～18.89和8.33～11.32 nmol/mg prot，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中變化不大(P＞0.05)。此外，MDA 含量在腎組織中略高于肝和鰓組織，其在肝、腎和鰓組織中的變化范圍分別為17.02～55.98、13.05～57.27 和8.33～53.93 nmol/mg prot。

圖4 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃肝、腎和鰓組織MDA 含量的影響Fig.4 Effects of salinity stress on MDA content in liver,kidney and gill of Luciobarbus capito

2.5 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃血清皮質(zhì)醇的影響

由圖5 可知，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇濃度在脅迫初期同一脅迫時(shí)間下，隨鹽度的升高呈顯著升高的變化趨勢(shì)(P＜0.05)；在同一鹽度條件下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇呈先上升后下降，并趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。血清中的皮質(zhì)醇濃度在脅迫24 h 時(shí)達(dá)到峰值，在鹽度脅迫48 h 時(shí)趨于平穩(wěn)；鹽度脅迫組大鱗鲃血清皮質(zhì)醇濃度為197.00～355.5 ng/L。而淡水對(duì)照組血清皮質(zhì)醇則為197.00～209.00 ng/L，其在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中含量變化差異不大。此外，血清皮質(zhì)醇的濃度變化與鹽度呈正相關(guān)。

圖5 鹽度脅迫對(duì)大鱗鲃血清皮質(zhì)醇濃度的影響Fig.5 Effects of salinity stress on serum cortisol concentration in L. capito

3 討論

ACP 和AKP 的磷酸化和去磷酸化主要作用于機(jī)體解毒過(guò)程，是衡量機(jī)體免疫機(jī)能的重要指標(biāo)(Sarà et al, 2008)。本研究發(fā)現(xiàn)，12 g/L 高鹽脅迫組中大鱗鲃肝、腎和鰓中ACP 和AKP 活力均高于其他3 個(gè)低鹽度組，表明鹽度越高，機(jī)體代謝強(qiáng)度越大，參與調(diào)控機(jī)體相關(guān)酶類磷酸化和去磷酸化過(guò)程的ACP 和AKP 活性也越高，徐力文等(2008)對(duì)軍曹魚(Rachycentron canadum)在鹽度脅迫下的研究也得出相同結(jié)論。在相同鹽度下，脅迫初期大鱗鲃3 種組織中ACP 和AKP 活力顯著上升，并在24 h 內(nèi)達(dá)到頂峰，脅迫48 h 后逐步下降并趨于平緩；但不同鹽度脅迫下，最終恢復(fù)平穩(wěn)的時(shí)間不同，高鹽度組恢復(fù)穩(wěn)定的時(shí)間顯著長(zhǎng)于低鹽組；此外，不同組織ACP 和AKP活力恢復(fù)穩(wěn)定的時(shí)間也不同，其中，肝組織中ACP和AKP 活力分別在7 d 和4 d 達(dá)到新穩(wěn)態(tài)，腎組織中2 種酶的活力均在48 h 達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，而鰓組織AKP活力在脅迫96 h 后恢復(fù)穩(wěn)定。腎組織中ACP 和AKP活力范圍分別為1.42～2.15 U/g prot 和1.01～1.87 金氏單位/g prot，其在3 種組織中活性最高，且恢復(fù)時(shí)間最短，而肝組織中酶活力恢復(fù)穩(wěn)定的時(shí)間則晚于腎組織，這可能與肝組織需要持續(xù)為機(jī)體提供能量有關(guān)。此外，鰓中酶活力范圍分別為0.98～1.96 U/g prot 和0.13～0.84 金氏單位/mg prot，鰓組織ACP 和AKP 活力恢復(fù)所需時(shí)間亦較長(zhǎng)，這可能與鰓直接接觸鹽度環(huán)境且酶活力較低有關(guān)系。

GSH-Px 是機(jī)體用于清除過(guò)氧化物的一種酶，能以GSH 為特異性底物降解過(guò)氧化氫和有機(jī)過(guò)氧化物，對(duì)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要的保護(hù)作用(Arthur, 2000)。本研究結(jié)果顯示，大鱗鲃肝、腎和鰓3 種組織在高鹽度脅迫下(12 g/L)的同一時(shí)間，GSH-Px 活力顯著高于低鹽度組，且鹽度變化與GSH-Px 活力呈正相關(guān)性；推測(cè)在高鹽脅迫下，機(jī)體代謝調(diào)控強(qiáng)度加大，為避免機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和有機(jī)過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體造成二次損傷，GSH-Px 活力也相應(yīng)增強(qiáng)，這與孫鵬等(2010)的報(bào)道一致。在相同鹽度條件下，脅迫初期大鱗鲃3 種組織中GSH-Px 活力顯著上升，其肝組織和腎組織在24 h 達(dá)到頂峰，而鰓組織則在6 h 達(dá)到峰值，在脅迫48 h 后逐步下降并趨于平穩(wěn)；高鹽度組恢復(fù)穩(wěn)定的時(shí)間明顯長(zhǎng)于低鹽度組；此外，3 種組織中GSH-Px 活力最終恢復(fù)穩(wěn)定的時(shí)間不同，肝組織中GSH-Px 活力在7 d 達(dá)到新穩(wěn)態(tài)，而腎和鰓均在96 h 恢復(fù)穩(wěn)定；此外，肝組織中GSH-Px活力最高，腎和鰓次之。肝是機(jī)體代謝供能的主要組織，其在機(jī)體鹽度適應(yīng)過(guò)程中需要高強(qiáng)度持續(xù)供能，產(chǎn)生的過(guò)氧化代謝廢物多，因此，GSH-Px 在活力和恢復(fù)穩(wěn)定所需時(shí)間均顯著強(qiáng)/長(zhǎng)于腎、鰓組織。

MDA 是生物體脂質(zhì)代謝過(guò)程中一種重要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，是衡量機(jī)體內(nèi)活性氧的水平和氧化應(yīng)激程度的重要指標(biāo)之一(Paust et al, 2011)。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫初期，相同時(shí)間下高鹽度組(12 g/L)大鱗鲃肝、腎和鰓組織中MDA 含量明顯高于低鹽度組，且鹽度越高，機(jī)體代謝產(chǎn)生的MDA 越多，這與楊靜雯等(2019)對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)在鹽度脅迫下的結(jié)論一致。相同鹽度條件下，脅迫初期大鱗鲃3 種組織中MDA 含量呈顯著上升趨勢(shì)，并在24 h 達(dá)到最高，脅迫48 h 時(shí)逐步下降并基本趨于平穩(wěn)；此外，腎組織中MDA 含量略高于肝和鰓組織。推測(cè)在鹽度脅迫下，3 種組織中脂質(zhì)物質(zhì)均參與了分解供能過(guò)程，但這一結(jié)論仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

皮質(zhì)醇是在下丘腦–垂體–腎上腺軸(HPI)分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素作用下，由頭腎細(xì)胞合成與釋放的一種糖皮質(zhì)類固醇激素，是反應(yīng)魚體應(yīng)激強(qiáng)度的重要指標(biāo)(Zong et al, 2019)。本結(jié)果顯示，鹽度脅迫下的血清皮質(zhì)醇在高鹽脅迫下(9 和12 g/L)顯著高于低鹽脅迫(3 和6 g/L)，且皮質(zhì)醇濃度隨鹽度的上升而上升，這與胡靜等(2016)的報(bào)道相一致。在同一鹽度下，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇在短期內(nèi)急速上升，并在24 h 時(shí)升至峰值，表明在魚體剛接觸鹽度環(huán)境時(shí)，大鱗鲃的腎間組織受到刺激并分泌大量的皮質(zhì)醇，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，到48 h 時(shí)，大鱗鲃逐漸適應(yīng)了水體鹽度環(huán)境，其血清中皮質(zhì)醇含量亦逐漸恢復(fù)至正常水平。

綜上所述，本研究中，3 種組織中抗氧化酶活力、MDA 含量以及血清皮質(zhì)醇，均在24 h 內(nèi)出現(xiàn)最大值，并在48 h 之后逐漸趨于平穩(wěn)，推測(cè)大鱗鲃在剛進(jìn)入鹽度環(huán)境時(shí)，魚體對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生了劇烈反應(yīng)，在曝露24 h 內(nèi)機(jī)體抗氧化能力逐步達(dá)到最強(qiáng)，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，魚體逐步適應(yīng)相應(yīng)的鹽度環(huán)境，其抗氧化能力也隨之恢復(fù)到正常水平，各指標(biāo)均基本趨于平穩(wěn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)大鱗鲃死亡現(xiàn)象，且在12 g/L 高鹽脅迫下3 種組織中各項(xiàng)指標(biāo)均能恢復(fù)穩(wěn)定水平，表明大鱗鲃對(duì)于高鹽水體環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，且能夠在12 g/L 高鹽環(huán)境下中正常生長(zhǎng)。