李 楊 閆世長 徐靜雯 謝鳳英 武利春 齊寶坤

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.國家大豆工程技術(shù)研究中心， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soybean protein isolate，SPI)具有加工性能好、營養(yǎng)價值高、成本低等優(yōu)點，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。SPI在特定食品中的應(yīng)用形式因其性質(zhì)而不同，如乳化性、溶解性、凝膠性、分散性以及粘度等。在天然狀態(tài)下，大豆蛋白的主要成分是儲藏蛋白，即7S和11S球蛋白，占總蛋白的65%～80%，蛋白質(zhì)的致密球狀結(jié)構(gòu)與低分子柔性以及不良的界面和乳化特性有關(guān)[1]。因此，研究者嘗試采用許多技術(shù)來修飾和改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)。

超聲已被引入來改變食品的功能特性，可依靠產(chǎn)生的空化作用或機械剪切應(yīng)力破壞蛋白的肽鍵以及非共價相互作用，改變蛋白的二級結(jié)構(gòu)和疏水性[2]。超聲與一些技術(shù)相結(jié)合可以改善蛋白質(zhì)的功能特性。pH變換技術(shù)簡單、易操作，且可以利用靜電排斥作用使蛋白解折疊與亞基解離，尤其是在遠(yuǎn)離蛋白等電點的pH值下，因此，超聲常與pH變換相結(jié)合來改善蛋白的功能特性[3]。文獻(xiàn)[4]報道了超聲聯(lián)合pH處理可使豌豆蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而改善其功能特性。文獻(xiàn)[2]研究發(fā)現(xiàn)，超聲復(fù)合酸處理可以改變SPI的結(jié)構(gòu)，使蛋白聚集體粒徑減小、乳化性增強。文獻(xiàn)[3]闡明了超聲復(fù)合堿處理對Oleosin蛋白的結(jié)構(gòu)及功能性的影響，超聲復(fù)合堿處理可改善蛋白結(jié)構(gòu)，提高其乳化性。文獻(xiàn)[5]研究發(fā)現(xiàn)，超聲復(fù)合堿處理較單獨處理技術(shù)更能改善乳蛋白的結(jié)構(gòu)與乳化特性。然而，超聲等物理改性雖可提高蛋白的功能特性，但產(chǎn)生的自由基卻可能加速蛋白的氧化[6]，從而限制了其在工業(yè)中的高值化應(yīng)用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)具有抗菌、抗氧化、抗炎以及抗腫瘤作用[7-9]，且具有較強的蛋白親和性，可以與蛋白復(fù)合形成具有功能性質(zhì)的復(fù)合體系[10]。文獻(xiàn)[11]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG與SPI相互作用，可改變蛋白的結(jié)構(gòu)，復(fù)合物的乳化性與抗氧化性均得到改善。文獻(xiàn)[12]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG與卵清蛋白相互作用，降低了蛋白的致敏性，提高了蛋白的乳化性。一些學(xué)者還研究了改性蛋白與多酚的相互作用。文獻(xiàn)[13]研究發(fā)現(xiàn)，熱與花青素改性SPI使蛋白復(fù)合物乳化性得到改善。文獻(xiàn)[14]研究發(fā)現(xiàn)，超聲改性的大豆蛋白與花青素的相互作用使乳化性能明顯提高。文獻(xiàn)[15]利用超聲輔助大蒜素來改善乳清蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高蛋白的溶解度與乳化特性。文獻(xiàn)[16]利用堿處理輔助EGCG改性乳清蛋白，復(fù)合物的乳化性與抗氧化性得到增強。由此可知，多酚類成分與蛋白相互作用可以用來改善蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，且可以清除氧化自由基，這拓展了蛋白在功能性食品中的應(yīng)用。然而，關(guān)于超聲復(fù)合堿處理SPI與EGCG復(fù)合對蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的影響尚未見報道。

本文主要采用熒光光譜、紅外光譜探究超聲復(fù)合堿處理SPI和EGCG復(fù)合體系對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，通過粒度分析、Zeta電位、濁度、乳化性及乳化穩(wěn)定性探究超聲復(fù)合堿處理SPI與EGCG復(fù)合體系對蛋白功能性質(zhì)的影響及變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，市售；EGCG(純度99%以上)，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇，均為分析純，北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-3C型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；F-6000型熒光分光光度計，日本Hitachi公司；TU-1800型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JJ-1型增力電動攪拌器，江蘇金城國勝儀器廠；Allegra64R型臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼公司；IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1樣品制備

(1)大豆分離蛋白制備

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，將大豆磨粉，過60目篩，用正己烷脫脂，將脫脂豆粉分散于去離子水中，液料比10 mL/g，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，攪拌1 h，9 000 r/min離心30 min，取其上清液，然后用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物水洗3次，6 500 r/min離心30 min得到沉淀物，將該沉淀物溶解后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，凍干，即得大豆分離蛋白，使用凱氏定氮法測定蛋白含量，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(92.28±0.31)%。

(2)超聲復(fù)合堿處理SPI和EGCG復(fù)合物制備

SPI的處理方法參照文獻(xiàn)[2,16]的方法進(jìn)行。

對照組(SPI)：稱取大豆蛋白1.0 g，溶解到100 mL的去離子水中，在25℃下攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH 維持pH值為7.0，然后在5 000 r/min的條件下離心15 min，得上清液，然后凍干。

超聲復(fù)合堿處理(UHSPI)：稱取大豆蛋白1.0 g，溶解到100 mL的去離子水中，25℃下攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH 維持pH 值7.0，200 W超聲處理5 min(工作5 s、間隔5 s)，隨后調(diào)節(jié)pH值至12，保持1 h，隨后再調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后在5 000 r/min條件下離心15 min，得上清液，然后凍干。

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行SPI和EGCG復(fù)合物的制備，將SPI和UHSPI粉末溶解在10 mmo/L的PBS(磷酸鹽緩沖液，pH值7.0)中，在室溫(20℃)下連續(xù)攪拌30 min，加入EGCG粉末，蛋白與EGCG質(zhì)量比為100∶1，連續(xù)攪拌90 min。絡(luò)合后，將混合溶液凍干進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.2紅外光譜

用IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜分光光度計在室溫下記錄樣品的紅外光譜。將樣品與KBr混合，然后壓片。在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)記錄光譜，分辨率為4 cm-1。采用Peakfit 4.12軟件，利用高斯曲線擬合方法擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的特征峰[17]，分析其含量。

1.3.3熒光光譜

向10 mL的SPI溶液(0.5 mg/mL, 10 mmol/L PBS, pH值7.0)中分別逐滴加入100 μL濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μmol/L的EGCG溶液，旋渦振蕩后應(yīng)用F-6000型熒光分光光度計測定樣品的熒光淬滅光譜[17]。光譜測定條件設(shè)置為：激發(fā)波長280 nm，掃描波長為300～450 nm，激發(fā)狹縫、發(fā)射狹縫為5 nm，掃描速率為600 nm/min。蛋白及復(fù)合物的熒光測定條件為，室溫條件下，以280 nm為激發(fā)波長，掃描波長為300～450 nm。熒光淬滅機制可分為動態(tài)淬滅與靜態(tài)淬滅兩種機制，應(yīng)用Stern-Volmer方程判斷猝滅類型，公式為

(1)

式中F0、F——未加入、加入EGCG時SPI溶液的熒光強度

Q——EGCG的濃度，mol/L

Kq——雙分子猝滅常數(shù)，L/mol

Ksv——動態(tài)猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)

τ0——猝滅劑不存在時熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s

一般情況下，猝滅劑對于生物大分子最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2×1010L/(mol·s)，當(dāng)大于這一速率時，則為靜態(tài)淬滅，靜態(tài)淬滅滿足公式

lg((F0-F)/F)=lgKa+nlgQ

(2)

式中Ka——表觀結(jié)合常數(shù)

n——結(jié)合位點數(shù)

1.3.4粒徑

利用Zetasize Nano ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀對樣品溶液進(jìn)行粒徑分布測定。顆粒折射率1.45，分散劑折射率1.33，吸附率0.001。實驗采用體積平均直徑D[4,3]表征粒徑大小并記錄溶液粒徑的PDI(多分散指數(shù))[13]。

1.3.5電位

采用Zeta電位儀測定樣品的Zeta電位，對樣品溶液進(jìn)行適度稀釋(樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，上樣量為1 mL，測定溫度為25℃，溫度平衡時間為2 min[18]。

1.3.6濁度

將待測樣品適當(dāng)稀釋后(樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL)倒入石英比色皿中，并利用紫外分光光度計在波長600 nm處測定樣品吸光度，用吸光度表示其濁度[19]。

1.3.7乳化特性

參照文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改。將樣品溶在PBS(10 mmol/L，pH值7.0)中至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，向稀釋的樣品中加入葵花油，水相與油相體積比為3∶1，使用高剪切均質(zhì)機以10 000 r/min均質(zhì)3 min形成乳狀液，立即從其乳狀液底部提取50 μL的乳液分散于0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋100倍。經(jīng)旋渦振蕩后用分光光度法在波長500 nm處測定樣品的吸光度A500nm，用相同濃度十二烷基硫酸鈉溶液作為空白對照，經(jīng)10 min后再次測量其吸光度。乳化活性指數(shù)直接用乳液吸光度表示，乳化穩(wěn)定性指數(shù)計算公式為

(3)

式中A0、A10——乳狀液在0、10 min時的吸光度

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 20軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)分析，當(dāng)P<0.05差異性顯著。利用Origin 2020進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

表1 加入EGCG前、后SPI的二級結(jié)構(gòu)相對含量Tab.1 Changes in the secondary structure content of SPI before and after adding EGCG %

2.2 熒光光譜分析

內(nèi)源性熒光對蛋白質(zhì)的色氨酸殘基所處的微環(huán)境變化和蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化具有較高的靈敏度，因此常作為檢測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化的手段。如圖2所示，與SPI相比，UHSPI的熒光強度顯著增加且發(fā)生明顯的紅移現(xiàn)象，這可能由于pH值12遠(yuǎn)離蛋白等電點(pI值約為4.5)，提供較多的靜電斥力，超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)及剪切應(yīng)力作用于SPI，破壞蛋白分子之間的相互作用，使蛋白分子展開，發(fā)色基團(tuán)暴露[2,5,16]。此外，與EGCG復(fù)合之后，復(fù)合物的熒光強度均降低，表明EGCG對蛋白的熒光起到猝滅作用[17]，同時發(fā)現(xiàn)SPI-EGCG復(fù)合物的最大吸收波長發(fā)生了紅移，UHSPI與EGCG作用熒光淬滅最明顯，表明EGCG與UHSPI的結(jié)合程度最強，可能是因為超聲處理、堿處理與EGCG協(xié)同改變了SPI的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，發(fā)色基團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生改變，由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境，肽鏈結(jié)構(gòu)舒展[14,16]。

2.3 粒徑分析

粒徑可以直觀地表示蛋白聚集體的形成。如圖3(圖中不同字母表示差異顯著)所示，與SPI相比，UHSPI的粒徑明顯減小，這可能因為超聲的空化和機械作用、堿處理產(chǎn)生的靜電斥力而最大程度地誘導(dǎo)較大的聚集蛋白塌陷和解離[2,23]，二者協(xié)同使蛋白結(jié)構(gòu)展開、蛋白分子間作用減弱、亞基發(fā)生解離，粒徑變小[3,5]，該結(jié)果與文獻(xiàn)[5]的研究結(jié)果一致。此外，與SPI相比，當(dāng)SPI與EGCG復(fù)合后，其粒徑顯著減小，且UHSPI-EGCG具有更小的粒徑，溶液PDI最小(0.32)，表明顆粒分布最為均一。這可能是由UHSPI與EGCG形成的復(fù)合物具有最強的負(fù)電性所致[13]。此外，文獻(xiàn)[24]表示，蛋白與多酚復(fù)合后，會較為明顯地改變蛋白的性質(zhì)，使二者內(nèi)部連接更緊密，從而改善溶液的粒徑分布情況。

2.4 電位分析

Zeta電位可以表征粒子之間的相互吸引能力。通過電位可以表征溶液的穩(wěn)定性，電位的絕對值越大，產(chǎn)生的靜電斥力越大，粒子之間越不容易發(fā)生相互碰撞導(dǎo)致聚集，反之，絕對值越小，粒子間越易相互碰撞發(fā)生聚集形成大顆粒[13]。與對照SPI相比((-12.48±0.18)mV)，UHSPI電位((-19.69±0.21)mV)絕對值顯著增加(P<0.05)，這可能是當(dāng)pH值變換(pH值由12到7)時，蛋白發(fā)生了解折疊的結(jié)構(gòu)變化，帶電基團(tuán)暴露[4,16]。此外，超聲利用空化作用打開蛋白結(jié)構(gòu)[2]，超聲的空穴效應(yīng)及機械剪切與堿提供的靜電斥力相協(xié)同，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)伸展，疏水性殘基及帶電基團(tuán)暴露，電位絕對值增加[5]。

SPI與EGCG復(fù)合后，溶液的電位絕對值均顯著增大(P<0.05), SPI-EGCG的電位為(-13.88±0.46)mV，UHSPI-EGCG的電位((-21.08±0.16)mV)絕對值最大?？赡苁怯捎贓GCG帶負(fù)電荷，并且在中性條件下酚羥基可以去質(zhì)子化，所產(chǎn)生的氧中心可以輸出較高的負(fù)電荷密度，與蛋白的正電基團(tuán)結(jié)合，使得SPI的負(fù)電荷相對增加[13]。此外，文獻(xiàn)[18]研究表明，多酚與乳蛋白復(fù)合后，可降低蛋白的等電點，復(fù)合物的負(fù)電性增強。

2.5 濁度分析

濁度的變化可以反映粒子的聚集情況，濁度主要與溶液的顏色、粒子的粒徑等有關(guān)[25]。與SPI(0.26±0.014)相比，UHSPI濁度(0.083±0.013)明顯減小，這可能是因為超聲改變了蛋白的三、四級結(jié)構(gòu)，以及堿處理提供的靜電斥力，使蛋白與蛋白的相互作用減小，濁度減小，從而提高溶液體系的穩(wěn)定性[3-5,16]。

SPI與EGCG復(fù)合之后，所有復(fù)合物溶液的濁度與單純蛋白溶液相比均顯著增加，SPI-EGCG的濁度為0.367±0.012，且UHSPI-EGCG具有最小的濁度(0.135±0.016)，這可能是由于復(fù)合物溶液的粒徑減小，PDI降低，溶液分散均勻，導(dǎo)致光發(fā)生漫反射，從而導(dǎo)致濁度的增加[24,26]。該結(jié)果與文獻(xiàn)[19]的研究結(jié)論一致，花青素與SPI相互作用，使蛋白的結(jié)構(gòu)改變，粒徑更加均勻，光的漫反射增加，溶液濁度增加。此外，由于EGCG在中性及堿性條件下不穩(wěn)定，易氧化成棕色的醌類物質(zhì)，所以，溶液的顏色加深，也可能導(dǎo)致濁度增加[25]。

2.6 乳化特性分析

乳化活性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)可以表征乳狀液的乳化特性及穩(wěn)定狀態(tài)。EAI表示乳化劑形成油-水界面的能力；ESI是指乳狀液形成小液滴的抗應(yīng)變能力[27]。如圖4(圖中不同小寫字母表示乳化活性指數(shù)差異顯著，不同大寫字母表示乳化穩(wěn)定性指數(shù)差異顯著)所示，未加入EGCG時，與SPI相比，UHSPI表現(xiàn)出最高的EAI和ESI，可能由于堿處理產(chǎn)生的靜電斥力與超聲產(chǎn)生的空化作用相輔相成，使蛋白的疏水基團(tuán)暴露，蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)舒展，分子柔性增加，從而提高其乳化性[2-5]。

SPI與EGCG復(fù)合后，UHSPI-EGCG具有最高的EAI(1.98)、ESI(394.52 min)，可能是由于EGCG的加入增強界面薄膜的表面壓力和黏彈性，形成較穩(wěn)定的界面膜，增加復(fù)合物的EAI[10]。另外，SPI與EGCG復(fù)合后，油-水界面層一部分被蛋白質(zhì)占據(jù)，另一部分被EGCG占據(jù)，形成第1層乳化膜，蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)充分暴露和EGCG通過疏水相互作用形成第2層的乳化膜，因此EAI顯著提升[13]。EGCG與SPI復(fù)合后，液滴間空間斥力的增加及表面電荷的變化，導(dǎo)致蛋白的ESI增強[22,24]。

2.7 熒光淬滅光譜分析

通過評估EGCG對蛋白內(nèi)源性熒光的淬滅情況，可分析EGCG與蛋白的結(jié)合強度[28]。如圖5所示，隨著EGCG濃度的不斷增加，SPI和UHSPI熒光強度均逐漸降低，說明EGCG對SPI的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了猝滅作用[17]。同時發(fā)現(xiàn)SPI的最大熒光發(fā)射波長隨著EGCG濃度的增加，發(fā)生了紅移，且UHSPI的變化程度最為顯著，這說明EGCG與SPI發(fā)生了結(jié)合，從而改變了SPI的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，Trp和Tyr的微環(huán)境發(fā)生改變，由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境，肽鏈結(jié)構(gòu)舒展[29]。

為評估EGCG與SPI的結(jié)合強度(圖6)，根據(jù)Stern-Volmer方程計算出SPI-EGCG復(fù)合物的動態(tài)猝滅速率常數(shù)(Ksv)和雙分子猝滅常數(shù)(Kq)，如表2所示，所有樣品的Ksv均大于最大動態(tài)淬滅速率常數(shù)(2×1010L/(mol·s))，表明為靜態(tài)淬滅[17]，另外，UHSPI具有最大的Ksv(3.094×1012L/(mol·s))，這表明EGCG與蛋白的結(jié)合強度最大，這可能是由于超聲產(chǎn)生的空化作用及堿誘導(dǎo)使蛋白的疏水性基團(tuán)暴露，EGCG與蛋白的疏水性結(jié)合增強[16]。

表2 SPI-EGCG復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)Tab.2 Fluorescence quenching constant, number of binding sites and apparent binding constant of SPI-EGCG complex

對于靜態(tài)淬滅，利用式(2)計算EGCG與SPI間的表觀結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n(表2)。從表2可以看出，EGCG與不同條件處理的SPI間的表觀結(jié)合常數(shù)數(shù)量級為104，說明EGCG與SPI發(fā)生了緊密的結(jié)合，且均形成了結(jié)合位點數(shù)接近于1的復(fù)合物，其中，UHSPI-EGCG的結(jié)合位點數(shù)最大(1.3)，說明EGCG與其結(jié)合得最為緊密，這與上文討論的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

(1)超聲復(fù)合堿處理可使SPI多肽鏈的骨架伸展、蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(α-螺旋相對含量減少，無規(guī)則卷曲相對含量增加)，改變了蛋白的聚集狀態(tài)，SPI乳化性能明顯增加。

(2)EGCG與SPI形成復(fù)合物，改變了蛋白構(gòu)象，顯著提高蛋白的乳化活性、乳化穩(wěn)定性，復(fù)合物溶液的粒徑減小，其中UHSPI-EGCG乳化性最強(EAI為1.98；ESI為394.52 min)。

(3)EGCG對SPI的淬滅機制為靜態(tài)淬滅，二者均可形成結(jié)合位點數(shù)近似于1的復(fù)合物，其中UHSPI-EGCG結(jié)合位點數(shù)最大(1.3)。