健脾清腸補腎方藥物血清對破骨細胞凋亡途徑的影響

張亞利，陳倩，戴彥成，2，張紫薇，唐志鵬

1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，屬炎性腸病范疇。研究顯示，UC可影響患者骨骼及鈣鹽的沉積[1-3]。近年來，UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥研究備受關(guān)注[4-5]。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨病，表現(xiàn)為骨脆性增加、易骨折，是UC 患者常見腸道外表現(xiàn)之一[6]。骨重建對維持骨骼完整性具有重要作用，其由成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收共同協(xié)調(diào)完成，破骨細胞異常導致這種內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破。骨質(zhì)疏松細胞學特征為破骨細胞的破骨活性強于成骨細胞的成骨活性，導致骨質(zhì)逐漸被吸收。因此，破骨細胞凋亡直接影響骨吸收，從而影響骨重建過程。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥中破骨細胞凋亡受到抑制[7-9]。前期臨床研究表明，健脾清腸方治療UC 取得較好療效[10-12]。健脾清腸補腎方是在健脾清腸方基礎(chǔ)上的拓展方，本實驗從破骨細胞凋亡機制入手，觀察健脾清腸補腎方藥物血清對成熟破骨細胞凋亡的影響，探討其治療UC并發(fā)骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮藥效的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

健脾清腸補腎方（黃芪30 g，黨參15 g，益智仁12 g，補骨脂9 g，馬齒莧30 g，甘草6 g，木香6 g，地榆15 g），飲片由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。浸泡飲片，煎煮2 次，過濾藥液，濃縮后濃度為含原藥材1.23 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 細胞

RAW264.7 細胞株來源于Abelson 鼠科白血病病毒誘導腫瘤，購于中國科學院上海生命科學研究院。

1.3 動物

雄性SD 大鼠，SPF 級，6 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2013-0017。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF 級動物房，溫度（23±3）℃，相對濕度35%～45%，光照12 h，自由攝食飲水。

1.4 主要試劑與儀器

核因子-κB 受體活化因子配基（RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），R&D 公司，批號分別為315-11、315-02；Bcl-2 抗體、Bax 抗體，CST 公司，批號分別為2876、2772；TRAP 染色試劑盒，Sigma公司，批號387A；Annexin V-FITC 和碘化丙啶凋亡檢測試劑盒，BD 公司，批號556420。低溫離心機（Eppendorf 公司，5804R 型），Accuri C6 流式細胞儀（Becton-Dickinson），純水儀（Heal Force 公司），垂直電泳儀（Bio-Rad 公司，PowerPac 型），全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（G：Box Chemi XT4，Syngene 公司）。

1.5 藥物血清制備

將實驗大鼠隨機分為2 組，每組5 只。健脾清腸補腎方組大鼠按15 mL/kg 給予健脾清腸補腎方煎劑灌胃，空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃，2 次/d，連續(xù)3 d。末次給藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動脈取血，無菌離心管收集，4 ℃靜置2 h，4 ℃、3000 r/min 離心15 min，混勻合并同組大鼠藥物血清，56 ℃恒溫水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｅ渲瞥山K濃度分別為2.5%、5%、10%的健脾清腸補腎方藥物血清培養(yǎng)液[終濃度（%）＝加入血清體積÷總體積×100%]，即低、中、高劑量健脾清腸補腎方。

1.6 RAW264.7 細胞形態(tài)學觀察

將RAW264.7 細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，使用DMEM 完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/L 青-鏈霉素和2.5 mg/mL 兩性霉素B）培養(yǎng)，每1～2 d 更換1 次培養(yǎng)液。待細胞融合至70%，用細胞刮將貼壁的RAW264.7 細胞刮下，離心后取新鮮培養(yǎng)液重懸，輕柔吹打均勻，細胞按1∶4 傳代。

1.7 破骨細胞誘導及鑒定

細胞經(jīng)計數(shù)，將RAW264.7 細胞按1×104個/cm2的濃度接種于培養(yǎng)板，加入100 ng/mL RANKL 和10 ng/mL M-CSF 共同誘導其分化。培養(yǎng)6 d 后，破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鑒定。加入臨時配制的TRAP 染色液，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫箱，避光孵育1 h；再用蘇木精復(fù)染3 min，PBS 沖洗3 次，倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。光鏡觀察TRAP 陽性多核（≥3 個）破骨細胞。

1.8 Annexin V/PI 雙染色法檢測破骨細胞凋亡

將破骨細胞接種于6 孔板，健脾清腸補腎方藥物血清（2.5%、5%、10%）對誘導分化成熟的破骨細胞進行干預(yù)，正常血清培養(yǎng)為空白對照。按不同培養(yǎng)條件分別加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d；將6 孔板中每孔細胞培養(yǎng)液吸出至15 mL 離心管，每孔再加入400 μL 胰蛋白酶消化3 min，1 mL 完全培養(yǎng)液終止消化，500 μL培養(yǎng)液洗孔1 次；將消化的細胞加入同一離心管，2000 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 mL 預(yù)冷無菌PBS 洗細胞沉淀1 次，用PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL；取100 μL 細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；室溫避光孵育15 min。加入5 μL 碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min；加300 μL 結(jié)合液；用流式細胞儀進行檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

1.9 Western blot 檢測破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達

按不同培養(yǎng)條件（空白對照組和健脾清腸補腎方低、中、高劑量組）培養(yǎng)細胞2 d；取干預(yù)后2×106個破骨細胞，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次；培養(yǎng)皿中加入100 μL 預(yù)冷的蛋白裂解液，置冰上10～20 min；細胞刮刮下細胞收集至EP 管，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液至另一新離心管；取少量上清液，用Bradford 檢測試劑盒進行蛋白質(zhì)定量；每個樣品上樣20 μg，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TBST 稀釋的Bcl-2 和Bax 一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后加入1∶2000 稀釋的二抗，室溫搖床上孵育2 h；TBST 洗膜；將PVDF 膜放入凝膠成像儀中調(diào)整位置和焦距，于PVDF 膜正面的目的條帶上滴加ECL 發(fā)光劑（試劑A 液與試劑B 液等體積混勻），動態(tài)集成5～15 min 并拍照，用Gel-Pro 分析軟件對條帶進行定位和分析。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0 和GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)用方差分析，進行多組間比較，組間比較用LSD-t檢驗，不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 破骨細胞觀察及鑒定結(jié)果

RAW264.7 細胞剛貼壁時呈類圓形；第2 日可見伸出的偽足、單核，極少數(shù)有2 個核；第3 日可見細胞開始發(fā)生融合，逐漸形成空泡樣多核巨噬細胞；第5 日細胞可融合形成破骨樣細胞。RAW264.7 細胞經(jīng)RNAKL＋M-CSF 聯(lián)合誘導培養(yǎng)4 d，可見少量TRAP染色陽性細胞，類圓形，體積比單核細胞大數(shù)倍；培養(yǎng)6 d，TRAP 染色陽性的細胞形狀不規(guī)則，多核（≥3 個），體積大，直徑可達50～100 μm，有偽足，可見囊泡，鏡下細胞核呈紫藍色，胞漿中TRAP 活性部位呈深紅色顆粒。見圖1。

2.2 健脾清腸補腎方對破骨細胞凋亡的影響

通過Annexin V/PI 雙染色法染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示，空白對照組破骨細胞早期凋亡率和總凋亡率分別為5.17%、6.68%，與空白對照組比較，健脾清腸補腎方各劑量組破骨細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），其中健脾清腸補腎方高劑量組最顯著，分別為15.21%、17.82%。見圖2、圖3。

圖2 破骨細胞Annexin V/PI 雙標記法流式細胞圖

圖3 各組破骨細胞凋亡率比較（，n＝3）

2.3 健脾清腸補腎方對破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響

與空白對照組比較，健脾清腸補腎方各劑量組Bcl-2 蛋白表達均明顯下調(diào)，Bax 蛋白表達均明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax 比值明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中健脾清腸補腎方高劑量組變化最顯著。見圖4、圖5。

圖4 各組破骨細胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 水平比較（，n＝3）

圖5 各組破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白免疫印跡圖

3 討論

UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥可歸屬中醫(yī)學“骨痹”范疇，感受外邪、飲食不節(jié)、情志失調(diào)及稟賦不足時，易致脾腎損傷，脾虛運化無力，痰濕內(nèi)生，日久化熱，致濕熱、痰濁、瘀毒內(nèi)生，與氣血搏結(jié)，壅滯于腸道；腎虛則精虧，骨無所養(yǎng)。脾腎虧虛是UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，濕熱蘊結(jié)腸道是其重要病機。健脾清腸補腎方是本課題組針對UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥創(chuàng)立的臨床協(xié)定方劑，是在前期研究健脾清腸方基礎(chǔ)上的拓展方，為健脾清腸方去白及、黃連，加益智仁、補骨脂，由黃芪、黨參、益智仁、補骨脂、地榆、馬齒莧、木香、甘草8 味藥組成。方中黃芪、黨參、益智仁、補骨脂健脾補腎，地榆、馬齒莧清熱涼血止痢，木香行氣止痛，甘草調(diào)和諸藥。全方標本兼治，共奏健脾清腸補腎之功。

正常成年人體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換需通過成骨細胞和破骨細胞的分化、激活及凋亡保持平衡。骨質(zhì)疏松癥通常表現(xiàn)為骨質(zhì)量和骨密度的降低，以及骨組織微結(jié)構(gòu)的改變。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是由英國阿伯丁大學病理學家Kerr 等[13]1972 年首次提出，其廣泛存在于多細胞生物的各種器官和組織中。線粒體凋亡通路是經(jīng)典的細胞凋亡途徑之一。線粒體是細胞產(chǎn)生能量的重要細胞器，是細胞氧化磷酸化和呼吸鏈的中心，也是細胞凋亡的調(diào)控中心。死亡受體介導的信號、生長因子抑制劑等許多因素均能使線粒體功能損傷，從而誘導細胞發(fā)生凋亡。健脾清腸補腎方藥物血清加入破骨細胞后，各劑量組破骨細胞凋亡率較空白對照組均顯著升高，且與藥物濃度呈正相關(guān)。提示健脾清腸補腎方可促進破骨細胞凋亡，高濃度健脾清腸補腎方藥物血清作用最顯著。

Bcl-2 家族是細胞凋亡的重要調(diào)控因子，由促凋亡和抗凋亡成員協(xié)同發(fā)揮作用。Bcl-2 可能通過干擾細胞色素C 的釋放從而阻斷Caspase 的激活，抑制細胞凋亡的發(fā)生；Bax 即Bcl-2 相關(guān)的X 蛋白，是Bcl-2家族中促凋亡的重要蛋白之一。Bcl-2 可與Bax 形成異二聚體。正常情況下，Bcl-2 和Bax 在細胞內(nèi)保持相對平衡。當Bcl-2 相對含量高于Bax 時，促進Bcl-2/Bax 異二聚體的形成，抑制細胞凋亡；當Bax相對含量高于Bcl-2 時，則抑制Bcl-2/Bax 異二聚體的形成，從而促進細胞凋亡[14-16]。因此，這2 種蛋白在異二聚體中所占比例可影響對細胞凋亡的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾清腸補腎方藥物血清可提高破骨細胞凋亡率，其機制可能是通過下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達、上調(diào)Bax 蛋白的表達而導致Bcl-2/Bax 比值下降，從而促進細胞色素C 等促細胞凋亡因子向細胞質(zhì)釋放而發(fā)揮作用。健脾清腸補腎方低、中、高劑量組均可促進破骨細胞凋亡，其中以健脾清腸補腎方高劑量組最明顯。

綜上，健脾清腸補腎方藥物血清可促進破骨細胞凋亡，其機制可能是通過線粒體凋亡途徑而發(fā)揮作用，通過下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達，上調(diào)Bax 蛋白的表達，從而促進破骨細胞凋亡。健脾清腸補腎方各劑量組均可促進成熟破骨細胞凋亡，其中以健脾清腸補腎方高劑量組最明顯。