王明清，龔魁杰，于麗娜，張初署，畢潔，宋昱，遲曉元，孫杰

(1. 山東省花生研究所，山東 青島 266100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，山東 濟南 250100)

嘔吐毒素，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)，是一種主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、粉紅鐮刀菌(F.roseum)和擬枝鐮刀菌(F.sporotrichioide)等鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素[1，2]。嘔吐毒素在被污染的小麥、玉米、大豆等糧食中廣泛存在，是食品和飼料中較常見的真菌毒素之一[3]。該毒素能通過影響免疫細胞增殖和免疫細胞因子生成從而降低機體的免疫力；還可抑制mRNA翻譯和調(diào)節(jié)蛋白激酶活性[4，5]，從而加速細胞凋亡，嚴重危害人和動物健康。1998年嘔吐毒素被國際癌癥研究機構(gòu)列為3類致癌物。因此，采取有效措施去除小麥、玉米等糧食和飼料中的嘔吐毒素，保障食品和飼料安全，對人和動物健康具有重要意義。

由于嘔吐毒素的化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，導致該毒素很難在加熱等處理中被破壞和去除。目前常用的脫除方法主要分為物理法、化學法和生物法[6]，其中物理和化學方法脫除效果不穩(wěn)定，同時還會破壞糧食中的營養(yǎng)物質(zhì)，并且容易引入新的污染物[7]。生物法主要是利用微生物產(chǎn)生的酶降解嘔吐毒素[8]，該方法具有效率高、專一性強、環(huán)保等優(yōu)點，受到廣泛關(guān)注，因此微生物降解已成為研究的熱點[9]。本試驗從小麥田土壤中分離到一株高效降解嘔吐毒素的菌株，并對其降解特征進行了研究，為其應(yīng)用于嘔吐毒素的脫除奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采集自山東省青島市小麥地；鄰苯二甲酸二正辛酯購自國藥集團化學試劑有限公司；嘔吐毒素標準品購自以色列Fermentek公司；Super GelRed熒光染料購自US Everbright Inc.；嘔吐毒素ELISA試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

液體初篩培養(yǎng)基[10](g/L)：0.25 g KH2PO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.5 g KNO3，0.5 g (NH4)2SO4，0.005 g CaCl2，0.003 g FeCl3·6H2O，2.0 g鄰苯二甲酸二正辛酯，pH 7.0，高壓滅菌15 min。

固體初篩培養(yǎng)基：初篩培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉。

復篩培養(yǎng)基(g/L)：10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，10 g NaCl，1 g KH2PO4，1 g葡萄糖，pH 7.0，高壓滅菌15 min。

1.3 降解嘔吐毒素菌株的初篩

取2 g土壤樣品于200 mL無菌水中，渦旋振蕩后取300 μL懸液至300 mL液體初篩培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)一周左右。當培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁后，在固體初篩培養(yǎng)基進行多次劃線純化，放置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 降解嘔吐毒素菌株的復篩

將初篩獲得的菌株接種于復篩培養(yǎng)基，37℃搖床發(fā)酵48 h。取發(fā)酵菌液1 980 μL，加入20 μL嘔吐毒素標準品(濃度為200 mg/L)，使最終體系中嘔吐毒素含量為2 000 μg/L，以加入同樣濃度嘔吐毒素的空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照。37℃孵育48 h后，采用嘔吐毒素ELISA試劑盒檢測嘔吐毒素含量。降解率計算公式為：

y(%)=(1-S/C)×100 。

式中，y是嘔吐毒素降解率，C是空白對照樣品中嘔吐毒素含量，S是處理樣品中嘔吐毒素含量。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 生理生化特征 于37℃培養(yǎng)箱對嘔吐毒素降解率最高的菌株進行培養(yǎng)，16 h后觀察菌落形態(tài)、色澤。觀察菌株革蘭氏染色反應(yīng)及其氧化酶、過氧化氫酶等活性。

1.5.2 細菌16S rRNA基因的擴增及分析 取10 mL菌株發(fā)酵液，利用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用通用引物27F和1492R[11]，利用PCR儀擴增16S rRNA基因。取5 μL PCR產(chǎn)物上樣于1.0%瓊脂糖凝膠，電泳結(jié)束后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴增產(chǎn)物，片段大小合理的產(chǎn)物送測序公司測序。測序獲得的16S rRNA基因序列在EzTaxon-e server中進行比對分析，然后用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[12]。

1.6 降解特性分析

對10 mL發(fā)酵菌體進行高速離心，制備胞外上清液。無菌水沖洗菌體后，加入10 mL無菌水制備菌懸液。通過超聲破碎菌懸液，再經(jīng)高速離心和0.22 μm無菌濾膜過濾獲得胞內(nèi)液。上清液、菌懸液、胞內(nèi)液3種組分中分別加入嘔吐毒素，37℃孵育48 h，利用試劑盒檢測各組分去除嘔吐毒素的效果。

1.7 對小麥樣品中嘔吐毒素的降解

將嘔吐毒素超標的小麥樣品經(jīng)研磨、滅菌，再經(jīng)40℃干燥至恒重，測量其嘔吐毒素的含量。取菌株發(fā)酵液，與上述嘔吐毒素超標的小麥樣品按照5∶1(體積質(zhì)量比)混合；以添加等體積液體培養(yǎng)基的小麥樣品作為空白對照，37℃孵育48 h，測量樣品中嘔吐毒素的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解嘔吐毒素菌株篩選

由圖1可知，菌株QD11、QD12、QD36、JJ15、ZJ4、ZJ5均能降解35%以上的嘔吐毒素，其中菌株QD36的降解率最高，為84.6%。因此選擇菌株QD36進行下一步研究。

圖1 各菌株降解嘔吐毒素的能力

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株QD36生理生化特征 菌株QD36在固體LB平板中生長較快，菌落凸起，乳白色，不透明，呈現(xiàn)皺褶(圖2)，該特征是芽孢桿菌的典型特征之一。革蘭氏染色呈陽性，具有氧化酶和過氧化氫酶活性。

圖2 菌株QD36的菌落形態(tài)

2.2.2 菌株QD36的16S rRNA基因鑒定 利用凝膠成像系統(tǒng)觀察16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物，在約1 500 bp處獲得一條特異性擴增條帶(圖3)。測序結(jié)果(圖4)表明菌株QD36與芽孢桿菌屬的菌株處于同一大的分支，其中與標準菌株BacillussiamensisPD-A10T聚類在一起，相似度高達99.9%。結(jié)合生理生化特征和16S rRNA基因分析結(jié)果，菌株QD36被命名為暹羅芽孢桿菌QD36(BacillussiamensisQD36)。

1, 2: 菌株QD36的16S rRNA基因; M: DL2000 DNA Marker。

2.3 菌株QD36降解特性

比較菌株QD36不同組分去除嘔吐毒素的能力，由圖5可知，上清液、菌懸液、胞內(nèi)液可分別去除84.1%、13.9%和6.5%的嘔吐毒素。該結(jié)果表明菌株QD36分泌至胞外的活性物質(zhì)主導嘔吐毒素的生物降解。

Bacillussiamensis: 暹羅芽孢桿菌;Bacillusvanillea: 香草芽孢桿菌;Bacillusvelezensis: 貝萊斯芽孢桿菌;Bacillusamyloliquefaciens: 解淀粉芽孢桿菌;Bacillusnakamurai: 中村芽孢桿菌;Bacillusthuringiensis: 蘇云金芽孢桿菌;Bacillusmycoides: 蕈狀芽孢桿菌;Bacilluscirculans: 環(huán)太芽孢桿菌;Bacilluscoagulans: 凝結(jié) 芽孢桿菌;Alicyclobacillusacidocaldarius: 酸熱脂環(huán)酸桿菌。

圖4菌株QD36的16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株QD36各組分嘔吐毒素降解率

2.4 菌株QD36降解小麥中嘔吐毒素試驗

以嘔吐毒素超標的小麥樣品為研究對象，經(jīng)48 h處理后，空白對照樣品S1的嘔吐毒素含量為2 530 μg/kg，加入菌株QD36處理的樣品S2嘔吐毒素含量為456 μg/kg(圖6)，降解率為82.0%。以上結(jié)果表明，菌株QD36能顯著降解小麥樣品中的嘔吐毒素，具有去除嘔吐毒素的潛力。

S1: 空白對照; S2: 加入菌株QD36處理的樣品。

3 討論與結(jié)論

被嘔吐毒素污染的小麥、玉米等糧食和飼料嚴重危害人和動物健康。由于物理、化學處理方法有多種缺點，因此生物法去除嘔吐毒素越來越受到研究人員的重視。梁含等[13]篩選了3株嘔吐毒素降解菌，分別是解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸菌，其中枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌組合對麩皮發(fā)酵處理可降解71%的嘔吐毒素。李曉鳳等[14]從土壤中篩選了一株腸桿菌，可降解40.4%的嘔吐毒素。譚劍等[9]篩選到一株枯草芽孢桿菌，該菌發(fā)酵液可降解玉米漿中80%的嘔吐毒素。余祖華等[15]篩選到一株蠟樣芽孢桿菌，可降解飼料中82.68%的嘔吐毒素。付苗苗等[16]從土壤中篩選到一株膿桿菌，可降解64.6%的嘔吐毒素，起降解作用的物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中。

本研究通過初篩和復篩從青島小麥地土壤中篩選到多株降解嘔吐毒素的菌株，其中菌株QD36具有較強的降解能力，可降解84.6%的嘔吐毒素，相對于已報道的多株降解菌株，該菌降解效率較高；結(jié)合生理生化特征和16S rRNA基因測序結(jié)果，菌株QD36鑒定為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)。該菌株對嘔吐毒素降解的活性物質(zhì)主要存在于上清液中，具有很好的應(yīng)用潛力。本研究為去除糧食和飼料中的嘔吐毒素提供了菌種資源。