柳絮，張華，宣寧，李平波，張夢(mèng)琦，姚方印

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物，為全球近一半人口的主食，因此水稻的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對(duì)保障世界糧食安全具有重要意義。病蟲(chóng)害是危害糧食安全的主要因素之一，水稻生產(chǎn)周期的某一個(gè)階段如果受到病蟲(chóng)害的侵襲，其產(chǎn)量和品質(zhì)將會(huì)受到極大的影響。

稻瘟病是水稻的主要病害，由病原菌Magnaportheoryzae引起。研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)量可以滿足6 000萬(wàn)人口的糧食需求，導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50億美元[1，2]。稻瘟病在水稻秧苗期至抽穗期均可發(fā)生。苗期或分蘗期發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，可導(dǎo)致植株死亡；穗期發(fā)病會(huì)導(dǎo)致白穗或半飽和穗，產(chǎn)量大幅度降低，嚴(yán)重時(shí)可造成水稻絕收。稻瘟病病原菌的生理小種多樣，并且變異復(fù)雜。因此，應(yīng)用單一的抗性水稻品種難以解決水稻持久抗稻瘟病的問(wèn)題。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的稻瘟病抗性基因被定位。本試驗(yàn)選用的供體親本空育131帶有廣譜稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2。

鱗翅目害蟲(chóng)一直是水稻上最大的威脅之一，由于水稻本身尚未發(fā)現(xiàn)有效的抗蟲(chóng)基因，傳統(tǒng)育種面臨很多困難。目前，Bt毒蛋白基因是使用最廣泛的抗蟲(chóng)基因，用轉(zhuǎn)基因的方法將Bt蛋白基因?qū)氤Ｒ?guī)水稻，可提高水稻對(duì)螟蟲(chóng)的抗性[3，4]。利用水稻抗稻瘟病基因優(yōu)質(zhì)資源，培育具有持久抗性的水稻品種，同樣是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效且對(duì)環(huán)境最安全的方法[1，5]。本實(shí)驗(yàn)室利用以秈稻明恢63為遺傳背景的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因株系T1C-19與黃淮稻區(qū)圣稻15進(jìn)行雜交和多代回交，已經(jīng)育成了帶有抗蟲(chóng)基因Cry1C，且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻新品系濟(jì)抗10號(hào)[6]。

目前，黃淮稻區(qū)生產(chǎn)上應(yīng)用的大部分水稻品種抗病蟲(chóng)能力不強(qiáng)，易遭受病蟲(chóng)為害，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)不穩(wěn)定[7，8]。為防治病蟲(chóng)害而大量使用農(nóng)藥則存在高成本、高毒性、高殘留等問(wèn)題，易造成環(huán)境污染，為食品安全帶來(lái)隱患。因此，對(duì)水稻品種的抗病蟲(chóng)性進(jìn)行改良，聚合不同的抗性基因，通過(guò)培育抗性品種防治病蟲(chóng)害更加經(jīng)濟(jì)、高效與環(huán)保。本試驗(yàn)利用濟(jì)抗10號(hào)為受體親本，選擇帶有廣譜高抗稻瘟病基因(Pi1，Pi2)的空育131為供體，進(jìn)行雜交與多代回交，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合田間農(nóng)藝性狀篩選，育成了抗蟲(chóng)和高抗稻瘟病以及適合黃淮稻區(qū)種植的4個(gè)優(yōu)良水稻新品系，為黃淮稻區(qū)抗病蟲(chóng)水稻育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親本材料

濟(jì)抗10號(hào)為本實(shí)驗(yàn)室利用以秈稻明恢63為遺傳背景的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因株系T1C-19與黃淮稻區(qū)圣稻15進(jìn)行雜交和多代回交選育而成，帶有抗蟲(chóng)基因Cry1C；帶有廣譜高抗稻瘟病基因(Pi1，Pi2)的空育131由黑龍江大學(xué)李榮田教授提供。利用濟(jì)抗10號(hào)為受體親本，空育131為稻瘟病抗性基因的供體親本進(jìn)行雜交與回交。

1.2 雜交與回交轉(zhuǎn)育過(guò)程

于8月中下旬選取正處于開(kāi)花期的水稻，以濟(jì)抗10號(hào)為母本，46℃溫水去雄，以空育131為父本進(jìn)行雜交獲得F1代，再以濟(jì)抗10號(hào)為輪回親本，連續(xù)回交獲得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在開(kāi)花前對(duì)每一個(gè)雜交或回交后代單株均進(jìn)行Basta(有效成分PPT)抗性選擇，PPT濃度為1 g/L[9]，PCR跟蹤稻瘟病抗性基因，并結(jié)合田間農(nóng)藝性狀，從中選擇抗蟲(chóng)且高抗稻瘟病植株再與輪回親本連續(xù)回交，或自交純和。

1.3 田間Basta抗性選擇

待水稻植株長(zhǎng)至20 cm左右時(shí)，用棉簽浸蘸除草劑Basta后涂抹在葉片正反面，3～5 d后統(tǒng)計(jì)抗性植株及敏感株數(shù)。涂抹處葉片顏色無(wú)變化的為抗性植株，葉片顏色變黃的為敏感植株。

1.4 抗稻瘟病基因功能標(biāo)記檢測(cè)

選取Basta檢測(cè)陽(yáng)性的植株，摘取幼嫩葉片，充分研磨，利用TPS法[10]提取DNA，備用。所篩選的與稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2緊密連鎖的多態(tài)性分子標(biāo)記分別為RM224和P131[11，12]，PCR反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系為：94℃ 5 min； 94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)[13]；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染，保鮮膜包膠保存并記錄結(jié)果。

1.5 稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定

自然誘發(fā)病圃設(shè)在濟(jì)南飲馬泉實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，病圃全生育期不噴灑殺菌劑，共進(jìn)行2次病情調(diào)查，分別為移栽前的苗葉瘟調(diào)查和黃熟期的穗頸瘟調(diào)查。苗葉瘟調(diào)查時(shí)在每個(gè)株系的發(fā)病中心選擇有代表性的病叢，以發(fā)病最重的20～50張葉片平均發(fā)病等級(jí)作為該株系的抗性級(jí)別；穗頸瘟調(diào)查時(shí)每小區(qū)至少100穗。田間的栽培管理、調(diào)查方法、病級(jí)劃分、記載標(biāo)準(zhǔn)和抗性評(píng)價(jià)按照顏群等[14]的水稻品種試驗(yàn)抗性鑒定方法與標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。稻瘟病綜合指數(shù)=苗葉瘟病級(jí)×25%+穗頸瘟發(fā)病率病級(jí)×25%+穗頸瘟損失率病級(jí)×50%。

1.6 田間抗蟲(chóng)鑒定

在不用任何藥劑防治的情況下，于每年稻縱卷葉螟高發(fā)期田間調(diào)查其危害情況及其引起的白穗發(fā)生情況，并統(tǒng)計(jì)白穗率。

1.7 雙抗材料的田間種植及農(nóng)藝性狀考察

在濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植高抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻材料，小區(qū)面積為66.7 m2，重復(fù)2次，同時(shí)種植濟(jì)抗10號(hào)為對(duì)照。田間管理同大田，但不施用任何防病蟲(chóng)農(nóng)藥?？疾斓霓r(nóng)藝性狀有抽穗期、株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)育經(jīng)過(guò)

2016年配置雜交組合濟(jì)抗10號(hào)(Cry1C)×空育131(Pi1，Pi2)；2017年以濟(jì)抗10號(hào)為輪回親本進(jìn)行回交，獲得BC1F1和BC2F1；2018年獲得BC3F1；2019年自交獲得BC3F2。

2.2 Basta抗性鑒定

2017年共檢測(cè)雜交后代單株158株，其中Basta抗性植株107株，敏感植株51株，然后選取Basta抗性植株進(jìn)行稻瘟病抗性分子標(biāo)記輔助選擇。選出的15個(gè)材料與輪回親本濟(jì)抗10號(hào)回交獲得的BC1F1代種子同年在海南南繁實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行加代選育獲得BC2F1，收獲的材料于2018年在濟(jì)南實(shí)驗(yàn)基地種植后繼續(xù)進(jìn)行Basta抗性鑒定，2018年共檢測(cè)回交后代單株255株，其中Basta抗性單株236株，選取抗性單株繼續(xù)進(jìn)行稻瘟病抗性分子標(biāo)記輔助選擇并進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀篩選。2018年選出的16個(gè)材料分別與輪回親本濟(jì)抗10號(hào)繼續(xù)回交獲得BC3F1，在水稻成熟期，通過(guò)農(nóng)藝性狀篩選和田間的稻瘟病抗性鑒定，篩選出了4個(gè)材料SK01、SK02、SK03、SK04，在2019年自交純和獲得BC3F2。

2.3 分離世代單株稻瘟病抗性基因功能標(biāo)記檢測(cè)

對(duì)每一世代單株均分別進(jìn)行稻瘟病抗性基因(Pi1，Pi2)的功能標(biāo)記檢測(cè)，選取與空育131(Pi1，Pi2)基因型相同的陽(yáng)性單株繼續(xù)與輪回親本濟(jì)抗10號(hào)進(jìn)行回交，部分功能標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果如圖1、圖2所示。

P1: 空育131(Pi1); P2: 濟(jì)抗10號(hào); 1～48: BC2F1代單株; 2, 3, 4, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 42: 帶有Pi1基因的純和單株; 5, 7, 9, 11, 13, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44: 帶有Pi1基因的雜合單株。

P1: 空育131(Pi2); P2: 濟(jì)抗10號(hào); 1～20: BC2F1代單株; 1, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 17, 18, 20: 帶有Pi2基因的雜合單株。

2.4 田間稻瘟病抗性鑒定

經(jīng)過(guò)雜交和回交轉(zhuǎn)育， 2019年6—9月對(duì)已自交純和的4個(gè)材料SK01、SK02、SK03、SK04進(jìn)行苗葉瘟抗性鑒定和黃熟期穗頸瘟抗性鑒定。與輪回親本濟(jì)抗10號(hào)相比，改良株系SK02的稻瘟病抗性明顯提高，稻瘟病綜合指數(shù)為3.5；輪回親本濟(jì)抗10號(hào)的稻瘟病綜合指數(shù)為6.9級(jí)，抗性評(píng)價(jià)為感病。4個(gè)改良株系稻瘟病綜合指數(shù)均在4.0以下，為抗病，其中抗性最好的是SK02(表1)。

2.5 親本與雙抗株系的田間抗蟲(chóng)性鑒定

2019年6—10月對(duì)已自交純和的4個(gè)材料SK01、SK02、SK03、SK04進(jìn)行田間抗蟲(chóng)性鑒定。在稻縱卷葉螟大發(fā)生時(shí)期，濟(jì)抗10號(hào)和已自交純和的4個(gè)雙抗株系幾乎沒(méi)有受到卷葉螟的危害，空育131的卷葉螟危害較為嚴(yán)重，白穗率為39.79%，而選育的4個(gè)雙抗株系的白穗率相當(dāng)?shù)停∮?.20%(表2)。

表1 稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

表2 親本與雙抗株系稻縱卷葉螟危害情況

2.6 田間農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

回交轉(zhuǎn)育的目的是為了將抗蟲(chóng)基因與抗稻瘟病基因聚合，創(chuàng)制出抗蟲(chóng)(Cry1C)和抗稻瘟病(Pi1，Pi2)的水稻新材料，所以在對(duì)抗性進(jìn)行選育的同時(shí)，更注重了對(duì)產(chǎn)量、品質(zhì)等綜合性狀的選育。由表3可知，SK01、SK02、SK03、SK04不僅表現(xiàn)出很好的抗蟲(chóng)、抗稻瘟病特性，而且表現(xiàn)出明顯

表3 親本及雙抗株系主要農(nóng)藝性狀

的豐產(chǎn)性狀；米質(zhì)與已育成的適宜于黃淮稻區(qū)種植的輪回親本濟(jì)抗10號(hào)相當(dāng)。

3 討論與結(jié)論

目前，有不少水稻抗病和抗蟲(chóng)基因已被定位和克隆，且有一部分基因被廣泛應(yīng)用于抗性育種中[15，16]，抗病蟲(chóng)的水稻品種培育也取得了一定進(jìn)展。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行基因聚合，將不同的抗病蟲(chóng)基因進(jìn)行組合將會(huì)為新育成的水稻品種提供更加穩(wěn)定和持久的抗性[17,18]。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)聚合水稻抗性基因已有很多先例，一些水稻新品系已成功選育，且部分品種(組合)已通過(guò)審定。倪大虎等[19]利用分子標(biāo)記輔助育種將Xa23和Pi9基因聚合在一起，聚合系既抗白葉枯病又抗稻瘟病，抗性和抗譜均與親本相當(dāng)。Liu等[20]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將2個(gè)褐飛虱基因Bph3和Bph27(t)導(dǎo)入易感品種Ningjing3中，得到的聚合系很大程度上提高了對(duì)褐飛虱的抗性，避免了由于褐飛虱影響而造成的產(chǎn)量損失。

雖然本實(shí)驗(yàn)室已成功選育出了適合于黃淮稻區(qū)種植的抗蟲(chóng)品種，但是稻瘟病仍是黃淮稻區(qū)的主要病害，每年都對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。在眾多的防治措施中，最為經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保和有效的控制稻瘟病方法是通過(guò)發(fā)掘、鑒定和利用廣譜持久抗性基因，培育并推廣抗病新品種，提高栽培品種的稻瘟病抗性水平，延長(zhǎng)品種的抗病周期。因此，本研究將分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，采用雜交、回交等方法將稻瘟病抗性基因轉(zhuǎn)入到本實(shí)驗(yàn)室已育成的適宜于黃淮稻區(qū)種植的轉(zhuǎn)基因新品系濟(jì)抗10號(hào)(Cry1C)中，育成了抗蟲(chóng)和高抗稻瘟病的優(yōu)良水稻新品系4個(gè)，為充分利用稻瘟病抗性基因和抗蟲(chóng)基因進(jìn)行聚合獲得雙抗的水稻材料提供了廣闊的前景。