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      非洲豬瘟病毒熒光定量PCR的建立及4種檢測(cè)試劑盒的比較

      2021-03-22 03:00:12肖琦蔣彩霞史慧趙霞玲錢雯嫻朱家平張馮禧溫立斌汪偉何孔旺
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年2期
      關(guān)鍵詞:熒光定量PCR靈敏性敏感性

      肖琦 蔣彩霞 史慧 趙霞玲 錢雯嫻 朱家平 張馮禧 溫立斌 汪偉 何孔旺

      摘要:為評(píng)估目前常用商品化非洲豬瘟熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒,參考OIE推薦的非洲豬瘟病毒(ASFV)熒光定量PCR方法合成引物和探針,建立非洲豬瘟病毒qPCR檢測(cè)方法(OIE-qPCR);并與市面4種ASFV檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了比較。以人工合成的ASFV p72基因TA克隆重組質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品,OIE-qPCR可以檢測(cè)到10~102 copies;而4種ASFV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒中,進(jìn)口試劑盒TF-qPCR能檢測(cè)到10 copies,進(jìn)口試劑盒ID-qPCR和國(guó)產(chǎn)試劑盒QD-qPCR能檢測(cè)到10~102 copies,而國(guó)產(chǎn)試劑盒LY-qPCR能檢測(cè)到102 copies。對(duì)健康豬組織樣及臨床模擬樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示:OIE-qPCR與4種檢測(cè)試劑盒之間的符合率為92.60%~99.03%。其中,陽性樣品CT值的相關(guān)系數(shù)為0.988~0.997(Perason法),表明各試劑盒之間相關(guān)性良好;但在檢測(cè)病毒核酸含量較低的樣品時(shí),各試劑盒結(jié)果之間存在一定差異,其中,TF-qPCR試劑盒顯示更高的陽性檢出率,ID-qPCR試劑盒和LY-qPCR試劑盒次之。本研究為臨床選用非洲豬瘟病毒快速檢測(cè)試劑盒提供了依據(jù)。

      關(guān)鍵詞:非洲豬瘟病毒;檢測(cè);熒光定量PCR;靈敏性;穩(wěn)定性;敏感性

      中圖分類號(hào):S852.65+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2021)02-0119-06

      收稿日期:2020-11-13

      基金項(xiàng)目:江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào):JATS[2019]403)。

      作者簡(jiǎn)介:肖琦(1980—),女,遼寧丹東人,博士,助理研究員,主要從事豬病及人獸共患病防控研究。E-mail:xiaoqi_2122@163.com。

      通信作者:何孔旺,研究員,主要從事豬病及人獸共患病防控研究。E-mail:kwh2003@263.net。

      非洲豬瘟自從2018年8月在我國(guó)首次報(bào)道[1]以來,對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。病原的快速檢測(cè)在防控非洲豬瘟上發(fā)揮著十分重要的作用。實(shí)時(shí)熒光PCR因其特異性高、敏感性好,是目前應(yīng)用最為廣泛的非洲豬瘟檢測(cè)技術(shù)[3]。市場(chǎng)上主流使用的試劑盒的品牌較多,既有國(guó)產(chǎn)品牌,也有進(jìn)口品牌。在實(shí)際使用過程中,各種品牌非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的效果是否存在差異,相關(guān)報(bào)道較少。為了建立統(tǒng)一的參比方法,本研究參考OIE推薦的非洲豬瘟病毒熒光PCR方法[4]合成引物和探針,建立非洲豬瘟病毒qPCR(簡(jiǎn)稱OIE-qPCR)檢測(cè)方法,以人工合成的非洲豬瘟病毒p72蛋白基因TA克隆為陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,以健康豬組織樣及臨床模擬樣品作為檢測(cè)對(duì)象,比較OIE-qPCR和4種臨床常用的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的靈敏性、穩(wěn)定性、特異性,為臨床檢測(cè)非洲豬瘟病毒時(shí)的試劑盒選用提供參考依據(jù)。

      1材料與方法

      1.1儀器與試劑

      QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng),購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司;美國(guó)MP*FastPrep-24樣品均質(zhì)儀,購(gòu)自美國(guó)MP公司。TIANDZ柱式動(dòng)物DNAout試劑盒、柱式病毒DNAout試劑盒,購(gòu)自北京天恩澤公司;TaKaRa Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、pMD19-T,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

      1.2病毒株

      豬圓環(huán)病毒2型p58株、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬細(xì)小病毒NADL-2株、豬瘟病毒HCLV株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒NJGC、豬流行性腹瀉病毒AH2012株,均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

      1.3商品化非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒

      國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口的商品化非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒各2種,共4種。國(guó)產(chǎn)試劑盒包括A公司非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒(簡(jiǎn)稱QD-qPCR試劑盒)、B公司非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒(簡(jiǎn)稱LY-qPCR試劑盒),進(jìn)口試劑盒有C公司非洲豬瘟(ASF)qPCR檢測(cè)試劑盒(TF-qPCR試劑盒)和D公司非洲豬瘟病毒DNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒(ID-qPCR試劑盒)。所有試劑盒均在其有效期內(nèi)使用。

      1.4臨床健康豬樣品

      1.4.1樣品來源共33份樣品。其中,豬脾臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)等組織樣品均來自江蘇某菜市場(chǎng),血清和唾液樣品來自江蘇某豬場(chǎng)。

      1.4.2樣品處理

      1.4.2.1組織樣品取100 mg組織樣品(脾臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié))置于無菌破碎管中,加入1 mL無菌PBS(pH值7.2)和3顆鋼珠,在樣品均質(zhì)儀上勻漿處理,然后以12 000 r/min離心3 min,吸取上清200 μL,置于1.5 mL無菌離心管中,用于DNA提取。

      1.4.2.2血清、唾液樣品血清、唾液樣品直接取上清200 μL,置于1.5 mL無菌離心管中,用于DNA提取。

      1.4.3DNA提取組織樣品用TIANDZ柱式動(dòng)物DNAout試劑盒,按其說明書提取DNA;血清、唾液樣品用TIANDZ柱式病毒DNAout試劑盒,按其說明書提取DNA。

      1.5非洲豬瘟病毒p72陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

      1.5.1非洲豬瘟病毒p72全長(zhǎng)基因合成根據(jù)GenBank中已登錄的非洲豬瘟病毒安徽株XCGQ(MK128995.1)序列,合成p72蛋白基因全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)度1 941 bp,委托寶生物工程(大連)有限公司合成。置于-20 ℃保存。

      1.5.2非洲豬瘟病毒p72全長(zhǎng)基因質(zhì)粒構(gòu)建將人工合成的p72全長(zhǎng)基因克隆至pMD19-T載體中,篩選獲得陽性重組質(zhì)粒,作為非洲豬瘟病毒p72基因核酸檢測(cè)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

      1.6非洲豬瘟病毒qPCR(OIE-qPCR)檢測(cè)方法的建立

      1.6.1引物和探針參照OIE推薦的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR方法[4],合成引物和探針。引物和探針序列見表1,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

      1.6.2反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照OIE推薦的方法,OIE-qPCR反應(yīng)體系為20 μL,其中水5.1 μL、Mix 10 μL、ROXⅡ 0.4 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、探針(10 μmol/L)0.5 μL、DNA模板2 μL;qPCR反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 120 s;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 60 s,40個(gè)循環(huán)。

      1.6.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照無CT值或無擴(kuò)增曲線;陽性對(duì)照CT值≤35,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,判為試驗(yàn)成立。檢測(cè)樣品CT值≤40,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,判為陽性;檢測(cè)樣品無CT值或CT值>40,判為陰性。

      1.6.4特異性試驗(yàn)按照“1.4.3”節(jié)的方法提取豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒核酸進(jìn)行OIE-qPCR特異性試驗(yàn)。

      1.7商品化非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法

      4種商品化非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒均為熒光定量PCR方法,按照各試劑盒說明書的要求進(jìn)行非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)。各試劑盒的反應(yīng)條件、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)等見表2。

      1.8OIE-qPCR與4種商品化檢測(cè)試劑盒的比較

      1.8.1靈敏性試驗(yàn)將“1.5”節(jié)獲得的非洲豬瘟病毒核酸陽性標(biāo)準(zhǔn)品p72全長(zhǎng)基因重組質(zhì)粒,用無菌ddH2O稀釋至103、102、101、100 copies/μL,用于 OIE-qPCR 及各商品化檢測(cè)試劑盒的靈敏度檢驗(yàn)。

      1.8.2重復(fù)性試驗(yàn)用OIE-qPCR及各商品化檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)稀釋到103、102、101、100 copies/μL 的p72全長(zhǎng)基因重組質(zhì)粒樣品,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

      1.8.3組織樣品及模擬臨床樣品的檢測(cè)比較用OIE-qPCR及4種商品化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)33份正常豬組織樣品和33份模擬臨床樣品(在陰性組織樣品中加入不同濃度的p72全長(zhǎng)基因重組質(zhì)粒),比較各試驗(yàn)盒的檢測(cè)符合率和相關(guān)系數(shù)。

      2結(jié)果與分析

      2.1OIE-qPCR檢測(cè)方法的建立

      用建立的OIE-qPCR檢測(cè)方法,檢測(cè)不同稀釋度的非洲豬瘟病毒p72全長(zhǎng)基因重組質(zhì)粒,能出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(圖1);而檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒等,均沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。

      2.2OIE-qPCR與4種商品化檢測(cè)試劑盒靈敏性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

      靈敏性試驗(yàn)結(jié)果表明:OIE-qPCR的靈敏度可以檢測(cè)到101~102 copies;4種商品化非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒中,有1種試劑盒(TF-qPCR)能檢測(cè)到101 copies,有2種試劑盒(QD-qPCR和ID-qPCR)能檢測(cè)到101~102 copies,有1種試劑盒(LY-qPCR)能檢測(cè)到102 copies。

      穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示:OIE-qPCR與4種商品化檢測(cè)試驗(yàn)盒,在檢測(cè)103 copies和102 copies濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒時(shí)均能100%檢出;在檢測(cè) 100 copies 時(shí),所有檢測(cè)結(jié)果均為陰性;檢測(cè)濃度為101 copies的陽性質(zhì)粒時(shí),TF-qPCR的陽性檢出率為100%,OIE-qPCR與QD-qPCR、ID-qPCR的陽性檢出率均只有33.3%,而LY-qPCR的陽性檢出率為0%(表3)。

      2.3OIE-qPCR與4種商品化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織樣品及臨床模擬樣品

      用OIE-qPCR方法及4種商品化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)33份臨床健康豬組織樣品及血清、唾液樣品,結(jié)果均為陰性;檢測(cè)33份臨床模擬樣品,結(jié)果出現(xiàn)一定差異(表4)。檢測(cè)結(jié)果顯示,OIE-qPCR方法檢測(cè)為陽性的22份樣品,4種商品化檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果也均為陽性,且CT值之間均有良好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.988~0.997(PERASON法)。但用OIE-qPCR方法檢測(cè)為陰性的樣品中,有6份樣品用4種商品化檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)出1份(QD-qPCR試劑)、3份(LY-qPCR試劑盒)、4份(TF-qPCR試劑盒)和3份(ID-qPCR試劑盒)陽性,提示在檢測(cè)核酸含量處于臨界值的臨床樣品時(shí),TF-qPCR試劑盒的陽性檢出率最高;在這6份檢測(cè)結(jié)果有差異的樣品中,僅1份樣品被3種試劑盒同時(shí)檢測(cè)為陽性,另有3份樣品被2種試劑盒檢測(cè)為陽性,其他2份樣品均只有1種試劑盒檢測(cè)為陽性,表明當(dāng)樣品中的非洲豬瘟病毒核酸含量較低時(shí),各試劑盒的檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異。此外,將用OIE-qPCR方法及4種商品化試劑盒檢測(cè)的CT值在30以上的14份樣品進(jìn)行相關(guān)性比對(duì)時(shí),相關(guān)系數(shù)為0.503~0.952,進(jìn)一步表明當(dāng)樣品中的非洲豬瘟病毒核酸含量較低時(shí),各試劑盒的檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,OIE-qPCR方法與4種商品化檢測(cè)試劑盒之間檢測(cè)結(jié)果的符合率為92.60%~99.03%(表5)。

      3討論

      非洲豬瘟最早于1921年在非洲肯尼亞被報(bào)告[5-6],屬于重大動(dòng)物疫病,豬一旦發(fā)病,死亡率可高達(dá)100%,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但迄今為止,全球還沒有安全、有效的非洲豬瘟商品化疫苗和藥物,非洲豬瘟的防控主要依賴于嚴(yán)格的生物安全措施。

      2018年8月我國(guó)首次報(bào)道非洲豬瘟疫情以來,經(jīng)過2年多的艱苦努力,我國(guó)非洲豬瘟防控工作取得了積極的成效,但是非洲豬瘟病毒已在我國(guó)定植,污染面較大,疫情點(diǎn)狀發(fā)生的態(tài)勢(shì)將在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)存在[7]。因此,迫切需要能夠在感染早期快速檢測(cè)出非洲豬瘟病毒的技術(shù),及時(shí)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒感染豬,及時(shí)撲滅疫情。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2020年5月印發(fā)的2020年第二版《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實(shí)施方案》中明確規(guī)定:具備良好生物安全防護(hù)水平的規(guī)模豬場(chǎng),在出現(xiàn)非洲豬瘟疫情時(shí),可以僅將發(fā)病豬舍作為疫點(diǎn)進(jìn)行處理;豬場(chǎng)在自檢時(shí)發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟陽性豬,也只需要撲殺陽性豬及其同群豬,而對(duì)其余豬群在隔離觀察21 d無異常且檢測(cè)為陰性的情況下,可以就近屠宰或繼續(xù)飼養(yǎng)。這一政策的出臺(tái)和調(diào)整,為規(guī)模豬場(chǎng)及時(shí)篩查和發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟陽性豬,精準(zhǔn)清除非洲豬瘟感染豬,保障豬群安全提供了政策保障,同時(shí)也對(duì)非洲豬瘟病毒檢測(cè)及篩查技術(shù)提出了更高的要求。

      非洲豬瘟病毒常見的檢測(cè)技術(shù)包括檢測(cè)抗原的ELISA方法[8]、熒光抗體試驗(yàn)[9]和試紙條檢測(cè)法[10],以及檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸的PCR方法[11]、實(shí)時(shí)熒光PCR法[12-16]和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[17]等。2019年6月11日,中國(guó)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心公布了通過專家評(píng)審的第二批非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑名單,其中一共有34種試劑,全部為核酸檢測(cè)類,包括熒光定量PCR類28種和等溫?cái)U(kuò)增類6種。但從實(shí)際應(yīng)用情況來看,熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒應(yīng)用最為廣泛,但目前,對(duì)多種非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性、特異性及穩(wěn)定性等尚缺乏較為系統(tǒng)的比較。

      由于現(xiàn)有的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒多數(shù)參照OIE推薦的以p72基因?yàn)榘袠?biāo)的熒光定量PCR(OIE-qPCR)方法研制,所以我們以O(shè)IE-qPCR方法為參照,對(duì)臨床常用的4種商品化非洲豬瘟病毒核酸qPCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明,OIE-qPCR方法與市面上使用較多的4種商品化非洲豬瘟病毒qPCR檢測(cè)試劑盒的符合率為92.60%~99.03%,在檢測(cè)臨床模擬強(qiáng)陽性樣品時(shí),各試劑盒的檢測(cè)結(jié)果之間均具有良好的相關(guān)性;因此,在臨床檢測(cè)和診斷中,尤其是在檢測(cè)已明顯表現(xiàn)出非洲豬瘟臨床癥狀的病死豬樣品時(shí),由于樣品中非洲豬瘟病毒核酸含量較高,所以幾種試劑盒均可以達(dá)到檢測(cè)要求。但是,在檢測(cè)非洲豬瘟病毒核酸含量較低的樣品(10~100 copies)時(shí),OIE-qPCR方法與4種商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果之間存在一定差異,僅進(jìn)口的TF-qPCR試劑盒能穩(wěn)定檢測(cè)到10 copies,進(jìn)口的ID-qPCR和國(guó)產(chǎn)的QD-qPCR以及OIE-qPCR的檢出范圍為10~102 copies,而另一種國(guó)產(chǎn)試劑盒LY-qPCR僅能檢測(cè)到102 copies。在6份檢測(cè)結(jié)果不一致的臨床模擬樣品中,進(jìn)口的TF-qPCR檢測(cè)出4份陽性樣品,ID-qPCR和LY-qPCR各檢測(cè)出3份陽性樣品,而QD-qPCR只檢測(cè)出1份陽性樣品;而且,各試劑盒檢出的陽性樣品之間,重合率非常低,僅有1份樣品同時(shí)被3種試劑盒檢測(cè)為陽性,另有2份樣品同時(shí)被2種試劑盒檢測(cè)為陽性,其他3份樣品均只有1種試劑盒檢測(cè)為陽性,表明在非洲豬瘟病毒核酸含量較低時(shí),各試劑盒檢測(cè)的結(jié)果會(huì)出現(xiàn)較為明顯的差異。提示在臨床篩查時(shí),一是盡量選擇敏感度高的試劑盒,二是當(dāng)樣品CT值在35或35以上時(shí),以及在沒有CT值時(shí),需要慎重判定結(jié)果,必要時(shí)可用不同的試劑盒重復(fù)檢測(cè),或?qū)ωi群連續(xù)采樣監(jiān)測(cè)。

      上述結(jié)果也提示,目前的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR方法雖然敏感度較高、特異性強(qiáng),但用于檢測(cè)拷貝量低的核酸樣品時(shí)(如未出現(xiàn)臨床癥狀的豬,或病毒感染早期的豬),還存在一定的局限。由于非洲豬瘟病毒在自然感染后的潛伏期為4~9 d,這也是早期診斷、早期精準(zhǔn)清除的關(guān)鍵時(shí)期,但由于在潛伏期內(nèi),感染豬的排毒量通常比較低,因此,需要進(jìn)一步提高非洲豬瘟檢測(cè)試劑盒的敏感度,以便能夠盡早篩查出可能感染的豬,實(shí)現(xiàn)早期精準(zhǔn)清除。

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