張浩然，魏晶晶，王慧春

(青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008)

猴頭菇(Hericiumerinaceus(Bull.) Pers.)是一種珍貴的真菌，又名猴頭菌、猴頭蘑、刺猬菌，屬于擔(dān)子菌門，傘菌綱，多孔菌目，齒菌科，猴頭菌屬。猴頭菇兼有藥用與食用的價(jià)值，中醫(yī)認(rèn)為其性平、味甘，可治療消化不良、胃脹、胃痛和神經(jīng)衰弱等癥狀；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為猴頭菇具有降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射等功效，有安全性高、毒副作用小的特點(diǎn)[1-2]。在食用方面，因其鮮嫩香醇的口感，歷來便有“山珍猴頭、海味燕窩”的說法[3]，早在明清時(shí)便作為皇室貢品，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴食材[4]。由于猴頭菇人工種植技術(shù)的推廣，猴頭菇進(jìn)入了尋常百姓家。目前市場(chǎng)上的猴頭菇多制成干品出售，近年以猴頭菇為原料的保健食品也出現(xiàn)在公眾視野中，譬如猴頭菇飲料、猴頭菇餅干、猴頭菇素肉干等[5]。

猴頭菇的主要活性成分是多糖，也是目前研究最多的活性物質(zhì)之一[6-7]。傳統(tǒng)的多糖提取主要采用熱

水回流浸提法[8]，該方法耗時(shí)長(zhǎng)、浸提劑用量大且效率不高(提取率<4.5%)[9]。近年來，超聲提取植物有效成分技術(shù)逐漸興起[10-11]。該技術(shù)是應(yīng)用超聲波強(qiáng)烈的“空穴作用”與機(jī)械效應(yīng)，通過提高細(xì)胞內(nèi)容物的透過性來提取植物有效成分，是一種物理破碎過程，具有操作簡(jiǎn)單、提取快速、提取率高等特點(diǎn)[12]。本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲法提取猴頭菇多糖的主要工藝條件，為猴頭菇多糖的開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇：青?；浐＾r(nóng)牧集團(tuán)溫室，烘干后切片粉碎，過40目篩，于55 ℃真空干燥，待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 猴頭菇多糖提取

猴頭菇脫脂預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取猴頭菇樣品若干置于索氏抽提裝置中，用三氯甲烷∶甲醇為2∶1(體積比)混合溶液作為提取液，于80 ℃回流脫脂3次，105 ℃烘干備用。

超聲提取多糖：脫脂預(yù)處理后，猴頭菇粉按各因素(提取時(shí)間、提取溫度、料液比)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以85%乙醇溶液作為提取劑，利用超聲波清洗機(jī)提取猴頭菇多糖，經(jīng)過濾，取濾液測(cè)定多糖含量，并計(jì)算猴頭菇多糖得率。

1.2.2 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取猴頭菇樣品若干置于索氏提取器中，先用乙醚回流脫脂2次，再用85%乙醇提取，設(shè)置提取時(shí)間(10，15，20，25，30 min)、提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL)，利用超聲儀(超聲頻率為25 kHz)提取猴頭菇多糖。以多糖提取率為衡量指標(biāo)，初步確定適合猴頭菇多糖超聲提取的工藝參數(shù)。每次改變一個(gè)因素進(jìn)行不同單因素實(shí)驗(yàn)，每實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)方法

《鹿鼎記》里，麗春院中到了嫖客，常常差韋小寶去買粽子。粽子整只用粽箬裹住，韋小寶要偷吃原亦甚難，但他總在粽角之中擠些米粒出來，嘗上一嘗。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì) L9(33)正交實(shí)驗(yàn)(見表1)，確定超聲提取猴頭菇多糖的最佳工藝條件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)該方法的可靠性。

表1 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of L9(33) orthogonal test

1.2.4 多糖含量測(cè)定

參照苯酚-硫酸法測(cè)定猴頭菇多糖含量[13]，具體操作過程如下：

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取105 ℃下干燥至恒重的分析純葡萄糖10 mg，加適量蒸餾水使其溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管精密移取1，2，3，4，5，6 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別定容至10 mL，精密吸取2 mL于10 mL比色試管中，各加1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，搖勻后靜置冷卻10 min，置于30 ℃水浴中10 min，用空白矯正零點(diǎn)，在490 nm下測(cè)定其吸光度。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=14.521X+0.0092，R2=0.9959，線性關(guān)系較好。

樣品的測(cè)定：取1 mL猴頭菇多糖提取液，用蒸餾水定容至10 mL，如上方法測(cè)定吸光度值。參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖含量，進(jìn)而計(jì)算猴頭菇多糖提取率：

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

式中：c為根據(jù)吸光度值計(jì)算出的猴頭菇多糖溶液質(zhì)量濃度，D為猴頭菇多糖溶液稀釋倍數(shù)，V為猴頭菇多糖溶液體積，m猴頭菇為猴頭菇原料干重。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 不同提取時(shí)間對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可知，在超聲提取15～20 min內(nèi)猴頭菇多糖提取率有明顯提升；當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高點(diǎn)4.96%；超聲時(shí)間超過20 min后，多糖提取率隨著超聲時(shí)間的增加而降低，這是由于超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、攪拌作用以及高的加速度，使有效成分快速進(jìn)入溶劑，從而提高了多糖提取率[14]。因此，選取最佳的超聲提取時(shí)間為20 min。

2.1.2 不同提取溫度對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響

在料液比 1∶15、超聲提取20 min的條件下，考察了超聲提取溫度對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響，見圖2。

圖2 超聲提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，多糖提取率上升較快，當(dāng)溫度超過50 ℃以后，多糖提取率上升幅度較小，這可能是由于隨著溫度的升高，超聲空穴作用加強(qiáng)，使細(xì)胞破碎程度過大，導(dǎo)致其他雜質(zhì)被溶出，進(jìn)而影響了多糖提取率。從節(jié)能角度考慮，選擇最佳超聲提取溫度為50 ℃。

2.1.3 不同料液比對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響

在提取溫度為50 ℃、提取時(shí)間為20 min的條件下，考察了料液比對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著提取劑乙醇的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先快速增加又逐漸降低的趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶15 (g/mL)時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高值5.41%，這可能是因?yàn)榱弦罕冗^小，多糖未被浸透導(dǎo)致其提取率偏低；料液比過高，溶出的蛋白質(zhì)與多糖重新結(jié)合使其提取率降低，同時(shí)還增加了后續(xù)處理時(shí)間和提取液濃縮成本。因此，最佳提取料液比為1∶15 (g/mL)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)3因素3水平的L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2，極差R值反映了3個(gè)因素對(duì)猴頭菇多糖提取率的影響，依次為提取溫度(B)>提取時(shí)間(A)>料液比(C)；猴頭菇多糖提取最優(yōu)水平組合是A2B3C2，即超聲時(shí)間20 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶15 (g/mL)，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有差異。

表2 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9(33) orthogonal experimental results

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合A2B3C2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在料液比1∶15 (g/mL)、提取溫度為50 ℃的條件下，超聲提取為15 min，猴頭菇多糖提取率為6.16%，高于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，確定超聲提取猴頭菇多糖的最優(yōu)工藝條件為：提取時(shí)間20 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶15 (g/mL)。

3 討論

多糖物質(zhì)作為目前科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，不僅有極高的營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥價(jià)值，還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。猴頭菇作為大型藥食兩用菌，其多糖有特殊、天然和高效的活性作用，有較好的抗氧化性，對(duì)多種自由基均有顯著的去除能力?，F(xiàn)已有猴頭菇多糖保健食品的研制，如猴頭菇多糖口含片和猴頭菇多糖飲料[15]。因此，研究能夠最大程度保留營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和活性成分的猴頭菇多糖提取方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

用超聲法提取猴頭菇多糖有簡(jiǎn)化提取步驟、減少對(duì)多糖的破壞、提取時(shí)間短、多糖得率高等優(yōu)點(diǎn)，在中草藥化學(xué)成分提取中具有明顯優(yōu)勢(shì)[16]。但目前儀器設(shè)備耗能高，應(yīng)用較少，推廣存在一定的難度。因此需要優(yōu)化超聲法提取猴頭菇多糖工藝，為后期推廣及產(chǎn)品的生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用單因素和正交試驗(yàn)法對(duì)猴頭菇多糖的超聲提取工藝進(jìn)行了探討，評(píng)價(jià)了提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)多糖提取率的影響，并優(yōu)化了提取工藝條件。對(duì)猴頭菇多糖提取率影響的主次順序?yàn)樘崛囟?提取時(shí)間>料液比，最優(yōu)的提取條件為：超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間20 min，料液比為1∶15 (g/mL)。在此條件下，猴頭菇多糖提取率達(dá)6.16%。該方法簡(jiǎn)化了猴頭菇多糖的提取步驟，避免了高溫和長(zhǎng)時(shí)間提取對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞，節(jié)省了成本，且多糖提取率較高，是一種較理想的高效又經(jīng)濟(jì)的猴頭菇多糖提取新工藝。