趙志平，唐闊，吉莉莉，陳林，韓煦，王衛(wèi)*

(1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106；2.四川輕化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

亞硝酸鹽是腌臘肉制品加工中常用的食品添加劑，具有護(hù)色、抑菌、抗氧化和改善風(fēng)味等作用[1-2]。李汴生等研究發(fā)現(xiàn)，使用亞硝酸鹽加工后的烤翅色澤呈現(xiàn)明亮的紅色，而未添加亞硝酸鹽的烤翅色澤黯淡，且表面發(fā)黃[3]。亞硝酸鹽的添加能顯著改善薩拉米的色澤，但不同添加量對(duì)薩拉米的色澤差異影響不大[4]。劉鵬雪等研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉可以顯著抑制哈爾濱紅腸中大腸桿菌的生長(zhǎng)，有效抑制脂肪氧化，發(fā)揮良好的

抗氧化作用[5]。亞硝酸鈉的添加可以增加干腌肉中醛類物質(zhì)的含量，對(duì)干腌肉亞油酸的氧化起到顯著的抑制作用[6]。然而，亞硝酸鹽會(huì)與生物胺反應(yīng)產(chǎn)生具有致癌作用的亞硝胺，影響肉制品的食用安全。

使用微生物發(fā)酵劑是降低發(fā)酵食品中亞硝酸鹽殘留的有效途徑。Kim等研究發(fā)現(xiàn)Pediococcusacidilactici，Pediococcuspentosaceus和Staphylococcuscarnosus能夠顯著降低發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽的殘留[7]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵劑不但能夠快速降低成熟期豬肉香腸亞硝酸鹽的殘留，而且可以抑制腸桿菌的生長(zhǎng)，提高了香腸的食用安全性[8]。田甜等研究發(fā)現(xiàn)，微生物混合發(fā)酵劑Pediococcuspentosaceus，Staphylococcuscarnosus，Staphylococcusxylosus，Debaryomyceshansenii，Lactobacillussakei可有效降低廣式香腸亞硝酸鹽的殘留[9]。

類球紅細(xì)菌富含類胡蘿卜素、輔酶Q10等抗氧化活性物質(zhì)[10-11]，具有多種代謝模式，易于培養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境脅迫能力強(qiáng)，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。本研究探討了類球紅細(xì)菌發(fā)酵過程中對(duì)亞硝酸鹽的降解作用及其影響因素，為類球紅細(xì)菌發(fā)酵劑的開發(fā)提供了一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

類球紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides2.4.1：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器

YP302N型電子天平 上海菁海儀器有限公司；PHS-3C-01型pH計(jì) 上海三信儀表廠；水浴恒溫振蕩器 金壇市金南儀器制造有限公司；HC-2518臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀設(shè)備有限公司；UV-1801紫外可見分光光度計(jì) 北京北分瑞利有限公司；EPED-E2-10TJ超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；756PC型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DHP-9160B通用型超凈工作臺(tái) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 類球紅細(xì)菌的活化與微氧培養(yǎng)

取-80 ℃保藏的菌種，在固體培養(yǎng)基上劃線[12]，于30 ℃避光條件下培養(yǎng)3 d。挑取單菌落接種到40 mL培養(yǎng)基中(50 mL錐形瓶)，30 ℃，150 r/min，避光振蕩培養(yǎng)至OD660為0.5～0.6。

1.3.2 類球紅細(xì)菌耐受亞硝酸鹽試驗(yàn)

1.3.3 亞硝酸鹽殘留分析

采用GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的分光光度法(鹽酸萘乙二胺法)。

1.3.4 亞硝酸鹽初始濃度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

1.3.5 溫度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

1.3.6 pH對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

1.3.7 溶解氧濃度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽的耐受性分析

隨著亞硝酸鈉含量的遞增，類球紅細(xì)菌OD660的吸光值也越來越小，生長(zhǎng)越來越慢，見圖1。

圖1 類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鈉的耐受性分析(P<0.01)

由圖1可知，添加亞硝酸鈉后，類球紅細(xì)菌的生長(zhǎng)速度明顯受到抑制(P<0.01)，但亞硝酸鹽的濃度不超過100 mg/kg時(shí)類球紅細(xì)菌仍能在相同時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明類球紅細(xì)菌對(duì)一定濃度的亞硝酸鈉有較好的耐受性。隨著亞硝酸鈉含量逐漸增加，抑菌能力逐漸增強(qiáng)，類球紅細(xì)菌的耐受能力逐漸減弱。類球紅細(xì)菌對(duì)100 mg/kg的亞硝酸鈉有較好的耐受性，符合食品加工過程中規(guī)定的使用量。類球紅細(xì)菌全基因組已測(cè)序[13]，信息學(xué)分析表明類球紅細(xì)菌基因組中不含有亞硝酸鹽還原酶基因[14]，說明該菌通過其他途徑降解亞硝酸鹽。

2.2 類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽分析

為探究類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鈉的降解性能，將類球紅細(xì)菌在含有100 mg/kg亞硝酸鈉的培養(yǎng)基中微氧培養(yǎng)，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)亞硝酸鈉殘留，結(jié)果見圖2。

圖2 類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉試驗(yàn)

由圖2可知，隨著類球紅細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中亞硝酸鈉的殘留量逐漸降低。發(fā)酵初期亞硝酸鈉降解速率較慢，發(fā)酵12 h時(shí)降解率僅為3.38%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝酸鈉降解率逐漸上升。發(fā)酵24，36，48，60，72 h后降解率分別達(dá)到11.32%、14.19%、17.95%、18.42%、22.98%。發(fā)酵72 h時(shí)降解亞硝酸鈉的能力最強(qiáng)，說明降解時(shí)間影響亞硝酸鈉的降解率，此現(xiàn)象與陳曦等的研究結(jié)果類似[15]。發(fā)酵期間各微生物對(duì)亞硝酸鈉的降解速率逐漸加快，可能是由于菌株生長(zhǎng)繁殖變快，菌體密度增加，促進(jìn)了亞硝酸鈉的降解作用[16]。

2.3 亞硝酸鹽初始濃度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽的影響

由圖3可知，菌株在培養(yǎng)12 h時(shí)，不同亞硝酸鈉濃度對(duì)其降解率沒有明顯影響。此時(shí)，類球紅細(xì)菌處于延滯期，菌體密度較低，亞硝酸鈉降解率較低。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌不斷生長(zhǎng)繁殖，亞硝酸鈉降解率也隨之升高。隨著亞硝酸鈉初始含量增高，類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鈉的降解率出現(xiàn)了先升高后下降的總體趨勢(shì)。這可能是由于亞硝酸鈉具有一定的抑菌性[17]，隨著濃度的增加，抑制了類球紅細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，從而降低了類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鈉的降解。亞硝酸鈉的初始用量分別為50，75，100，125，150 mg/kg時(shí)，降解72 h后降解率分別達(dá)到了23.21%、26.52%、21.26%、14.50%、15.70%，表明亞硝酸鈉的降解率與亞硝酸鈉的初始濃度有關(guān)，此現(xiàn)象與龔鋼明等[18]和朱英蓮等[19]的研究結(jié)果相似。

圖3 亞硝酸鹽濃度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽的影響Fig.3 The effect of substrate concentration on the degradation of nitrite by Rhodobacter sphaeroides

2.4 溫度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽的影響

溫度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽有較大的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

由圖4可知，培養(yǎng)12 h時(shí)，不同溫度對(duì)亞硝酸鈉的降解率沒有顯著性變化，亞硝酸鈉降解率均較低。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝酸鈉的降解率均不斷升高，20，25，30，35 ℃發(fā)酵72 h后，降解率分別達(dá)到20.20%、31.80%、33.66%、35.98%，表明溫度對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉有顯著影響，此現(xiàn)象與王爽等[20]和張二康等[21]的結(jié)果相似。

2.5 pH對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

pH對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉有較大的影響，見圖5。

圖5 pH對(duì)類球紅細(xì)菌細(xì)菌降解亞硝酸鹽的影響

由圖5可知，培養(yǎng)12 h時(shí)，pH對(duì)亞硝酸鈉的降解率沒有顯著的影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和初始pH增大，亞硝酸鈉降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在72 h后，初始pH為6.0，6.3，6.6，6.9，7.2時(shí)，降解率分別達(dá)到了26.62%、27.21%、21.11%、20.40%、18.20%。pH為6.0和6.3時(shí)，亞硝酸鈉的降解率較高，說明pH影響類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉，此現(xiàn)象與劉玉廷等[22]和蘇容容等[23]的研究結(jié)果相似。

2.6 溶解氧對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鈉的影響

由圖6可知，在搖床轉(zhuǎn)速不變的情況下，通過改變錐形瓶中培養(yǎng)液的體積以改變培養(yǎng)液中的溶解氧。培養(yǎng)12～48 h時(shí)，隨著溶解氧的降低，亞硝酸鈉的降解率沒有發(fā)生顯著性變化。48 h后隨著時(shí)間逐漸增加，亞硝酸鈉降解率均不斷地升高，發(fā)酵72 h時(shí)裝液量為40%、50%、60%、70%、80%的降解率分別達(dá)到了20.89%、23.14%、26.73%、25.43%、34.65%。裝液量范圍在70%～80%，培養(yǎng)72 h，亞硝酸鈉降解率較高，說明溶解氧對(duì)細(xì)菌降解亞硝酸鈉具有較大的影響，此結(jié)果與Kampman等[24]和Sun等[25]的研究結(jié)果類似。

圖6 溶解氧對(duì)類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽的影響

3 結(jié)論

本研究探討了類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽的降解作用以及影響因素。類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽具有較好的耐受性，在100 mg/kg的亞硝酸鹽脅迫下能夠較好地生長(zhǎng)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽的效率得以提高。類球紅細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽的降解受溫度、pH、亞硝酸鹽初始濃度和溶解氧等因素的影響。本研究為類球紅細(xì)菌降解亞硝酸鹽提供了一定的理論基礎(chǔ)。