申長(zhǎng)衛(wèi) 袁敬平

摘 要： SWEET（sugar will eventually be exported transporter）家族是一種新型的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，該家族基因在碳水化合物運(yùn)輸、發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性和寄主-病原相互作用等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為更好地了解南瓜發(fā)育的分子機(jī)理，該研究基于已知的南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)中國(guó)南瓜SWEET基因（CmSWEET）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、保守基序、啟動(dòng)子預(yù)測(cè)、共線性預(yù)測(cè)和基因復(fù)制等進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明：共鑒定到21個(gè)CmSWEET 基因，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析將21個(gè)CmSWEET基因分為4個(gè)亞族（I，II，III和IV），分別包含3、5、10和3個(gè)基因。此外，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域和保守基序發(fā)現(xiàn)CmSWEET在進(jìn)化過(guò)程中是非常保守的。染色體定位結(jié)果顯示，CmSWEET基因不均勻地分布在21條中國(guó)南瓜染色體中的13條染色體上，且在染色體Cm00、Cm01、Cm03、Cm05、Cm07、Cm09、Cm19和Cm20上不存在。啟動(dòng)子順式作用元件分析顯示，CmSWEET基因與植物激素（脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸和生長(zhǎng)素）響應(yīng)有關(guān)，也可能參與各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)。從系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)和基因共線性方面揭示了CmSWEET基因與印度南瓜SWEET（CmaSWEET）之間的進(jìn)化關(guān)系。該研究在全基因組水平上系統(tǒng)地鑒定了中國(guó)南瓜中SWEET基因家族，為進(jìn)一步了解中國(guó)南瓜和其他葫蘆科作物SWEET基因提供了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步的功能分析提供了重要的候選基因。

關(guān)鍵詞： 南瓜， SWEET， 系統(tǒng)發(fā)育分析， 共線性， 順式作用元件， 生物信息學(xué)

Abstract： SWEET （sugar will eventually be exported transporter） is a new type of sugar transporter， which plays important roles in carbohydrate transport， development， environmental adaptability and host pathogen interaction. In order to better understand the molecular mechanism of pumpkin development， we used bioinformatics methods to comprehensively analyzed the phylogenetic tree， gene structure， transmembrane structure， conserved motif， promoter prediction， collinearity prediction and gene replication of the Cucurbita moschata SWEET gene （CmSWEET）， based on the known pumpkin genome database. The results were of follows： 21 CmSWEET genes were identified and divided into four subfamilies （I， Ⅱ， Ⅲ and IV） by phylogenetic analysis， including 3， 5， 10 and 3 genes respectively. In addition， the gene structure， transmembrane domain and conserved motif showed that CmSWEET genes were very conserved in evolution. The results of chromosome mapping showed that CmSWEET genes were unevenly distributed on 13 of 21 chromosomes and did not exist on chromosomes Cm00， Cm01， Cm03， Cm05， Cm07， Cm09， Cm19 and Cm20. Analysis of promoter cis-acting element showed that the CmSWEET genes were related to plant hormone response （abscisic acid， methyl jasmonate， salicylic acid and auxin）， and may also participate in response to various environmental stresses. Finally， the phylogenetic relationship was revealed from phylogenetic tree and gene collinearity. This study systematically identified the SWEET genes family in C. moschata at the whole genome level， which provided a basis for further understanding the SWEET gene of C. moschatas and other Cucurbitaceae crops， and also provided an important candidate gene for further functional analysis.

Key words： pumpkin， SWEET， phylogenetic analysis， collinearity， cis-acting elements， bioinformatics

可溶性糖，如蔗糖、葡萄糖和果糖是光合作用的主要產(chǎn)物，可作為碳骨架的來(lái)源，用于許多其他細(xì)胞化合物、信號(hào)、滲透壓細(xì)胞和運(yùn)輸分子的生物合成，并可作為瞬時(shí)能量?jī)?chǔ)存（Feng & Frommer， 2015）。在植物中，糖在源葉中合成，并且可以通過(guò)韌皮部從葉片運(yùn)輸?shù)礁?、莖、花、果實(shí)和種子，為新細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)（Ruan， 2014;Miao et al.， 2017）。糖類(lèi)化合物不能獨(dú)立跨植物生物膜系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)輸，而需要相應(yīng)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞或亞細(xì)胞間隔的吸收或釋放。迄今為止，三種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族已被鑒定，即單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（monosaccharide transporters， MSTs）（Slewinski， 2011）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sucrose transporters， SUTs）（Kühn & Grof， 2010;Ayre， 2011）和糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sugars will eventually be exported transporters， SWEETs）（Chen et al.， 2010），它們決定著作物的產(chǎn)量和質(zhì)量（Eom et al.， 2015）。

MSTs和SUTs為MFS超家族，具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Kühn & Grof， 2010;Ayre， 2011;Slewinski， 2011）。SWEETs是最近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)糖外流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，選擇性地在細(xì)胞內(nèi)或質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)單糖或雙糖，它們屬于MtN3家族（Chen， 2014;Eom et al.， 2015）。SWEET廣泛分布于各種生物中，包括原核生物、動(dòng)物和植物（Patil et al.， 2015）。真核SWEET蛋白在結(jié)構(gòu)上具有7次跨膜α-螺旋（Trans Membrane Helix， TMH/TM），由2個(gè)具有3次重復(fù)的TMH組成的MtN3基序和位于其中起連接作用的1個(gè)TMH構(gòu)成（陳慧敏等，2017;Liu et al.， 2019）。與真核SWEET蛋白相反，原核SWEET蛋白（即半SWEET蛋白）僅含有一個(gè)3-TM，這可能表明真核SWEET蛋白是通過(guò)復(fù)制和融合原核半SWEET蛋白中存在的基本3-TM單元而進(jìn)化來(lái)的（Xuan et al.， 2013）。

目前，對(duì)SWEET的功能研究在短柄草、高粱、番茄、葡萄、大豆、玉米和茉莉花等多個(gè)物種中進(jìn)行了部分報(bào)道（Yuan & Wang， 2013;Chong et al.， 2014;Feng et al.， 2015;Patil et al.， 2015;Sosso et al.， 2015;胡麗萍等，2017;王盼盼，2019），研究較深的主要集中在擬南芥和水稻上（Chen et al.， 2010;Xuan et al.， 2013）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SWEET基因參與對(duì)脅迫的響應(yīng)（Seo et al.， 2011）、宿主與病原菌互作（Slewinski， 2011;Cong et al.， 2014;Hu et al.， 2014）和植物衰老的調(diào)控（Zhou et al.， 2014）等生理過(guò)程，也參與糖的運(yùn)輸、分配和貯藏及生殖生長(zhǎng)的發(fā)育（Le et al.， 2015;李安琪，2017;馮超陽(yáng)，2018）。越來(lái)越多的研究表明，植物SWEET基因可能在糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面起廣泛作用。

中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)蔬菜作物之一。甜度是南瓜口感的關(guān)鍵指標(biāo)，而南瓜SWEET基因家族在糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面的功能及作用機(jī)理仍不清楚。據(jù)我們所知，目前還沒(méi)有對(duì)葫蘆科南瓜作物SWEET基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的研究報(bào)道。此外，南瓜基因組的測(cè)序（Sun et al.， 2017）促進(jìn)了南瓜SWEET基因家族成員的研究。本文對(duì)中國(guó)南瓜SWEET基因的系統(tǒng)發(fā)育、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、順式作用調(diào)控元件和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)分析，鑒定了印度南瓜SWEET基因，為瓜類(lèi)SWEET基因家族的研究以及進(jìn)一步探討南瓜SWEET基因家族對(duì)糖分轉(zhuǎn)運(yùn)的功能提供有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 中國(guó)南瓜SWEET基因家族的鑒定

從擬南芥信息資源（http：//arabidopsis.org）中獲得的17個(gè)AtSWEETs基因用作查詢序列。依據(jù)已獲得的擬南芥SWEET基因，對(duì)南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cucurbitgenomics.org/）進(jìn)行BLASTP分析，確定候選基因。去除冗余序列后，中國(guó)南瓜的所有候選SWEET蛋白序列都被提交到SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-hei-delberg.de）（Letunic et al.， 2015）和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//pfam.xfam.org）（Finn et al.， 2016），消除不包含已知的MtN3/唾液/SWEET家族成員保守結(jié)構(gòu)域和基序的基因。用同樣的方法從南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)出印度南瓜SWEET基因家族成員。

運(yùn)用ExPASy的“Compute pI/Mw”工具（http：//web.expasy.org/compute_pi/）來(lái)預(yù)測(cè)南瓜SWEET蛋白的等電點(diǎn)和分子量;運(yùn)用Plant-mPLoc server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）預(yù)測(cè)每個(gè)SWEET基因的亞細(xì)胞定位;運(yùn)用TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)SWEET蛋白質(zhì)跨膜（TM）螺旋數(shù)量。

1.2 中國(guó)南瓜SWEET基因的染色體分布

在南瓜數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取SWEET基因的起始位置、終止位置和染色體長(zhǎng)度，利用TBtools繪制中國(guó)南瓜全基因組CmSWEET基因家族成員分布圖。

1.3 中國(guó)南瓜SWEET的結(jié)構(gòu)分析和蛋白互作分析

在南瓜數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取SWEET基因的cDNA及其相應(yīng)基因的DNA序列，在此基礎(chǔ)上利用在線軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/） （Hu et al.， 2015）繪制CmSWEETs的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。利用在線軟件MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）（Bailey & Elkan， 1995）對(duì)中國(guó)南瓜SWEET蛋白的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。MEME參數(shù)設(shè)置：motif數(shù)量為10，motif長(zhǎng)度為5～50。以擬南芥SWEET蛋白為參考蛋白，利用在線STRING Version11.0平臺(tái)進(jìn)行分析。

1.4 中國(guó)南瓜SWEET啟動(dòng)子中的順式作用元件分析

在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得SWEET基因的閱讀框，利用TBtools獲取起始密碼子的前2 000 bp。在此基礎(chǔ)上將所有基因的啟動(dòng)子序列使用PLant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)ClustalW對(duì)所有南瓜SWEET蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)。中國(guó)南瓜SWEET蛋白與印度南瓜和擬南芥SWEET蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系由MEGA 5.10構(gòu)建（Tamura et al.， 2011）。使用成對(duì)刪除空位的選項(xiàng)，采用bootstrap法對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行評(píng)估，重復(fù)值設(shè)為1 000。

1.6 中國(guó)南瓜SWEET基因的共線性和基因復(fù)制

利用TBtools獲取中國(guó)南瓜SWEET基因在印度南瓜和擬南芥中的共線性基因及這些基因在染色體上的位置。用Circos（Krzywinski et al.， 2009）軟件繪制SWEET基因的共線關(guān)系圖。

使用TBtools程序?qū)λ蠸WEET的CDS序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，并使用公式計(jì)算基因的比對(duì)覆蓋率：基因比對(duì)覆蓋率=（比對(duì)長(zhǎng)度-錯(cuò)配）/較大基因的長(zhǎng)度。依據(jù)先前在白菜物種的報(bào)道，當(dāng)氨基酸一致性>80%、E期望值<1×10-10且基因比對(duì)覆蓋率>0.75時(shí)，這些基因被認(rèn)為是復(fù)制對(duì)（Yuan et al.， 2019）。當(dāng)兩個(gè)基因間隔小于100 kb時(shí)被認(rèn)為是串聯(lián)復(fù)制基因（Wang et al.， 2010）。使用KaKs calculator計(jì)算同義替換率（Ks），依據(jù)公式T=Ks / 2λ×10-6（MYA）（Emanuelsson et al.， 2000）來(lái)計(jì)算SWEET基因的分化時(shí)間（T），式中λ為1.5×10-8。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜SWEET基因家族成員的鑒定及其在染色體上的分布

由表1可知，從中國(guó)南瓜基因組中共鑒定出21個(gè)具有保守結(jié)構(gòu)域的CmSWEET基因。21個(gè)CmSWEET基因根據(jù)其在擬南芥中的同源基因命名。每個(gè)AtSWEET基因?qū)?yīng)1～5個(gè)CmSWEET基因。CmSWEET基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）的長(zhǎng)度在597～918 bp之間，編碼多肽的長(zhǎng)度在198～305 aa之間。這些SWEET多肽的分子量（Da）和等電點(diǎn)（pI）分別為21 998.71～33 974.59 Da和7.51～9.83。此外，除了CmSWEET12c在線粒體中、CmSWEET17a在細(xì)胞膜/高爾基體/過(guò)氧化物酶體中，其他CmSWEETs都定位在細(xì)胞膜上。

由圖1可知，共有21個(gè)CmSWEET基因位于21條染色體中的13條染色體上。染色體Cmo15含有最多的CmSWEET基因（4個(gè)，19%），而染色體Cmo00、Cmo01、Cmo03、Cmo05、Cmo07、Cmo09、Cmo19和Cmo20上沒(méi)有CmSWEET基因。染色體Cmo10上含有3個(gè)CmSWEET基因，染色體Cmo11、Cmo12和Cmo13上都含有2個(gè)CmSWEET基因，其余每一條染色體含有1個(gè)CmSWEET基因。由表2可知，共線性分析發(fā)現(xiàn)共有4對(duì)同源基因?qū)?，分別是CmSWEET1a_CmSWEET1b、CmSWEET12a_CmSWEET12d、CmSWEET10a_CmSWEET10b、CmSWEET7b_CmSWEET7c，其中依據(jù)氨基酸序列一致性>80%和基因比對(duì)覆蓋率>0.75，本研究在中國(guó)南瓜染色體上共發(fā)現(xiàn)1對(duì)片段復(fù)制基因?qū)Γ–mSWEET10b_CmSWEET10a），Ka/Ks<1.0表明這些復(fù)制對(duì)主要經(jīng)歷了純化選擇，分化時(shí)間為20.13 MYA。

2.2 中國(guó)南瓜SWEET蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

使用默認(rèn)值以FASTA格式提交給TMHMM Server v. 2.0推測(cè)了中國(guó)南瓜SWEET蛋白21個(gè)成員的氨基酸序列。圖2結(jié)果顯示，17個(gè)CmSWEET蛋白有7個(gè)TMs，1個(gè)CmSWEET蛋白有5個(gè)TMs，其余的3個(gè)CmSWEET蛋白（CmSWEET1b、CmSWEET5b和CmSWEET7b）有6個(gè)TMs。

2.3 中國(guó)南瓜SWEET蛋白的系統(tǒng)發(fā)育及結(jié)構(gòu)分析

為更好地了解南瓜SWEET基因的進(jìn)化起源和功能，利用Clustal Omega和MEGA 5.10軟件，通過(guò)對(duì)21個(gè)CmSWEET蛋白序列和17個(gè)AtSWEET蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建了無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。這些SWEET蛋白序列被分為4個(gè)亞族（圖3）。圖3比較了中國(guó)南瓜和擬南芥四個(gè)不同分支中的SWEET蛋白數(shù)量。每個(gè)分支都包含CmSWEET和AtSWEET。詳細(xì)地說(shuō)，第I亞族包含3個(gè)CmSWEETs （CsSWEET1a、CsSWEET1b和CsSWEET3）和3個(gè)AtSWEETs （AtSWEET1-3）;第Ⅱ亞族包含5個(gè)CmSWEETs （CmSWEET5a-5b、CmSWEET7a-7c）和5個(gè)AtSWEETs （AtSWEET4-8）;第Ⅲ亞族包含9個(gè)CmSWEETs （CsSWEET9、CsSWEET10a-10b、CsSWEET12a-12e和CsSWEET15a-15b）和7個(gè)AtSWEETs （AtSWEET9-15）;第IV亞族包含3個(gè)CmSWEETs （CmSWEET17a-17c）和2個(gè)AtSWEETs （AtSWEET16-17）（圖3）。

對(duì)基因結(jié)構(gòu)的分析可以為CmSWEET基因家族的外顯子-內(nèi)含子和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供有價(jià)值的信息。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的基礎(chǔ)上，利用GSDS工具分析了21個(gè)CmSWEET基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子階段和保守基序（圖4）?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)基序1、2、3和5在所有的中國(guó)南瓜SWEET蛋白中都存在（圖4： A， B;圖5）;基序4只在CmSWEET17b中不存在，基序7除在CmSWEET12a、CmSWEET17b蛋白中缺失，在其他蛋白中都存在;基序6只在第Ⅲ、第IV亞族中存在;基序8、9、和10只存在個(gè)別蛋白中（圖4： B）。外顯子-內(nèi)含子分類(lèi)模式與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致（圖4： C）。在中國(guó)南瓜SWEET基因家族中，所有CmSWEET基因的基因組序列都含有內(nèi)含子。CmSWEET12a-12d、15a-15b、10a-10b、9、17a、17c、1a-1b、3和5a包含6個(gè)外顯子，除CmSWEET15a外，它們的內(nèi)含子階段模式相似（圖4： C）。

CmSWEET12e、7a-7c都包含5個(gè)外顯子，除CmSWEET12e外，它們的內(nèi)含子階段模式相似。此外，CmSWEET17b和CmSWEET5b分別含有3個(gè)和4個(gè)外顯子，且具有不同的內(nèi)含子階段模式（圖4：C）。

2.4 中國(guó)南瓜SWEET基因啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件的研究

為了解CmSWEETs基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們從翻譯起始位點(diǎn)（ATG）提取了21個(gè)基因的2.0 kb上游序列。在PlantCARE服務(wù)器上對(duì)21個(gè)基因上游序列中的順式元件進(jìn)行分析。圖6：A為順式作用元件在啟動(dòng)子上的位置。值得注意的是，在CmSWEETs的啟動(dòng)子區(qū)共鑒定出9種植物激素響應(yīng)順式元件，包括1種脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、2種茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA基序和TGACG基序）、3種赤霉素響應(yīng)元件（GARE基序、P-box和TATC-box）、1個(gè)水楊酸響應(yīng)元件（TCA元件）和2個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-box和AuxRR-core）（圖6：B）。21個(gè)CmSWEET基因的啟動(dòng)子至少含有一個(gè)植物激素響應(yīng)元件。CmSWEET7b含有最多（15個(gè)）植物激素響應(yīng)元件（圖6： B）。CmSWEET基因除了受植物激素響應(yīng)元件的調(diào)控外，還可能對(duì)各種環(huán)境脅迫，如厭氧、高溫、低溫、干旱和晝夜節(jié)律（圖6：B）。厭氧響應(yīng)元件除在CmSWEET12d中不存在，存在所有的CsSWEET啟動(dòng)子中（圖6），提示這些基因在厭氧誘導(dǎo)中的重要作用。然而，晝夜節(jié)律僅在CmSWEET12e、CmSWEET10a和CmSWEET17a中存在（圖6： B）。這些數(shù)據(jù)表明CmSWEET可能通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制參與環(huán)境脅迫，并且每個(gè)CmSWEET基因都可以被不同的環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)。

2.5 中國(guó)南瓜SWEET蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)模式物種擬南芥中的同源序列，構(gòu)建了中國(guó)南瓜SWEET蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。由圖7可知，CmSWEET5a對(duì)應(yīng)AtSWEET5（AtVEX1）;CmSWEET9對(duì)應(yīng)AtSWEET9;CmSWEET1a對(duì)應(yīng)AtSWEET1;CmSWEET12a對(duì)應(yīng)AtSWEET12; CmSWEET17a對(duì)應(yīng)AtSWEET17;CmSWEET7a對(duì)應(yīng)AtSWEET7;CmSWEET3對(duì)應(yīng)AtSWEET3。圖7結(jié)果顯示，CmSWEET9分別與CmSWEET5a和CmSWEET1a;CmSWEET17a分別與CmSWEET12a、CmSWEET3和CmSWEET7a存在互作關(guān)系。

2.6 中國(guó)南瓜與印度南瓜SWEET蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

采用與中國(guó)南瓜相同的方法，從印度南瓜基因組中共鑒定到19個(gè)CmaSWEET基因（表3）。根據(jù)擬南芥的同源基因命名了19個(gè)CmaSWEET基因。無(wú)根進(jìn)化樹(shù)顯示19個(gè)CmaSWEET被分為4個(gè)大分支，與前面中國(guó)南瓜SWEET的分類(lèi)一致（圖8）。其中，在CmaSWEET中，中國(guó)南瓜SWEET家族中第IV亞族成員又被分為3個(gè)小分支。每個(gè)大分支都包含中國(guó)南瓜SWEET蛋白和印度南瓜SWEET蛋白。從綜合來(lái)看，兩個(gè)栽培種SWEET蛋白系統(tǒng)進(jìn)化相對(duì)保守。

2.7 中國(guó)南瓜與印度南瓜和擬南芥SWEET基因的共線性分析

利用TBtools工具獲取CmSWEET基因在CmaSWEET和AtSWEET基因中的共線性基因，并對(duì)這些共線性關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。圖9結(jié)果表明，中國(guó)南瓜與印度南瓜SWEET的共線性基因?qū)?shù)目（18）大于中國(guó)南瓜與擬南芥的共線性基因?qū)?shù)目（12）。此外，統(tǒng)計(jì)中國(guó)南瓜SWEET基因在印度南瓜和擬南芥中的拷貝數(shù)的結(jié)果（圖9，表4）發(fā)現(xiàn)，CmSWEET10a和CmSWEET10b對(duì)應(yīng)印度南瓜1個(gè)SWEET基因（CmaSWEET10）;AtSWEET1對(duì)應(yīng)CmSWEET1a和CmSWEET1b;AtSWEET10對(duì)應(yīng)CmSWEET10a和CmSWEET12c兩個(gè)基因;AtSWEET5對(duì)應(yīng)CmSWEET15b和CmSWEET17a兩個(gè)基因。因此，我們認(rèn)為中國(guó)南瓜SWEET基因與印度南瓜的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)擬南芥進(jìn)化關(guān)系更加緊密，中國(guó)南瓜SWEET基因在葫蘆科的多倍化事件中得到了擴(kuò)張。

3 討論與結(jié)論

SWEET基因家族在植物界廣泛分布，并參與許多重要的生理和生化過(guò)程（Yuan & Wang， 2013;Chen， 2014;Chandran， 2015;Eom et al.， 2015;Patil et al.， 2015）。然而，僅在基因組水平上鑒定了SWEET基因家族的少數(shù)物種，如擬南芥、水稻、番茄和大豆（Chen et al.， 2010;Yuan et al.， 2014;Feng et al.， 2015;Patil et al.， 2015）。據(jù)我們所知，迄今為止尚未有關(guān)葫蘆科南瓜屬作物的SWEET基因家族的系統(tǒng)研究報(bào)告。本研究中，我們通過(guò)分析中國(guó)南瓜的系統(tǒng)發(fā)育、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用調(diào)控元件等，探索了中國(guó)南瓜中的21個(gè)SWEET基因。

基因復(fù)制，包括片段復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和全基因組復(fù)制，他們?cè)谏锏倪M(jìn)化過(guò)程中起重要作用（Xu et al.， 2012）。中國(guó)南瓜在經(jīng)歷了核心真雙子葉植物共同的六倍體（core-eudicot common hexaploidization， ECH）事件（115～130百萬(wàn)年前） （Jaillon et al.， 2007;Jiao et al.， 2011）后，又經(jīng)歷了葫蘆科共有的全基因組加倍（cucurbit-common tetraploidization， CCT）事件的證據(jù)（Wang et al.， 2018），而后南瓜屬共享一次最近的全基因組加倍事件CST[古多倍體事件（Cucurbita-specific tetraploidization， CST）]（于繼高等，2020）。在中國(guó)南瓜中發(fā)現(xiàn)4對(duì)SWEET共線基因?qū)Γ?有一對(duì)復(fù)制基因（CmSWEET10b-CmSWEET10a），由于這兩個(gè)基因不在同一條染色體上，因此我們認(rèn)為是片段復(fù)制基因?qū)?。由Ka/Ks<1可知，中國(guó)南瓜SWEET基因正在進(jìn)行純化正向選擇。

通過(guò)對(duì)中國(guó)南瓜和擬南芥SWEET蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)他們被分配到4個(gè)亞族，這一分類(lèi)與先前擬南芥的分類(lèi)一致（Hu et al.， 2017）。將中國(guó)南瓜和印度南瓜SWEET蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)大分支都含有中國(guó)南瓜和印度南瓜SWEET蛋白，這表明中國(guó)南瓜和印度南瓜在進(jìn)化上可能來(lái)自同一個(gè)祖先。

通過(guò)SWEET基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)同一亞族中的大多數(shù)基因在或外顯子數(shù)目或內(nèi)含子數(shù)量方面具有相似的結(jié)構(gòu)特征，這一現(xiàn)象與先前其他物種中SWEET家族結(jié)構(gòu)特征相似（Yuan et al.， 2014;Feng et al.， 2015）。然而，同一個(gè)亞族中的CmSWEET17a和CmSWEET17b，與同一亞族中的其他CmSWEETs相比，它們含有不同數(shù)量的外顯子，這說(shuō)明中國(guó)南瓜SWEET基因家族的結(jié)構(gòu)多樣性。就特定的序列基序而言，在不同的亞族之間也檢測(cè)到高度差異。然而，在一個(gè)共同的亞族中，大多數(shù)中國(guó)南瓜SWEET蛋白具有保守的基序，這表明同一亞族可能具有相似的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，21個(gè)CmSWEETs基因啟動(dòng)子序列中的植物激素順式元件和脅迫響應(yīng)相關(guān)。在所有的CmSWEETs基因啟動(dòng)子中，至少發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與植物激素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，這意味著相應(yīng)的激素可能在其調(diào)節(jié)中起著重要作用。此外，所有CmSWEETs基因至少包含一個(gè)應(yīng)激相關(guān)的順式作用元件，表明這些基因在應(yīng)激響應(yīng)中也起著重要的調(diào)控作用。然而，還需要進(jìn)一步地研究來(lái)確定這些順式元件是否以及如何在中國(guó)南瓜中起作用。

在中國(guó)南瓜中發(fā)現(xiàn)21個(gè)CmSWEETs，在印度南瓜中發(fā)現(xiàn)19個(gè)CmaSWEETs。Hu et al.（2017）在黃瓜中發(fā)現(xiàn)17個(gè)CsSWEETs。中國(guó)南瓜、印度南瓜與黃瓜都是密切相關(guān)的，雖然黃瓜有7條染色體，中國(guó)南瓜和印度南瓜都有21條。詳細(xì)的共線基因?qū)瓦M(jìn)化關(guān)系分析揭示了葫蘆科三種重要作物染色體進(jìn)化和重排的高度復(fù)雜性。因此，黃瓜、中國(guó)南瓜和印度南瓜中SWEET基因的相似性水平特別高，這些同源的SWEET基因可能具有相似的功能。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）