決明子蒽醌苷對非酒精性脂肪肝病大鼠脂酸β 氧化相關(guān)酶蛋白表達(dá)的影響*

李玉晶，侯 偉，陳文慧，龍雨霏，武俊紫△

1 昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，云南 昆明 650600；2 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

近年來隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生率逐年升高［1］。有研究［2-4］顯示，我國不同地域、不同飲食的人群NAFLD 的患病率一致，約占總?cè)藬?shù)的12%～24%。目前對于本病的治療尚無特效藥，因此開發(fā)新的治療藥物十分必要。決明子蒽醌苷為我國藥食同源目錄中決明子的主要藥理成分，有抗脂質(zhì)過氧化、降脂、清除自由基及維持細(xì)胞膜穩(wěn)定等作用［5］。其對脂肪肝病的治療雖有文獻(xiàn)［6］報(bào)道，但是有關(guān)作用機(jī)理的研究相對較少，本研究通過脂酸β氧化核心蛋白過氧化物酶酰基輔酶A 氧化酶1（peroxidase acyl coenzyme a oxidase 1，ACOX1）和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（carnitine palmi toyl transferase 1A，CPT1A）探討決明子蒽醌苷對NAFLD 的治療作用及其機(jī)理，為決明子蒽醌苷的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí) SD 大鼠 60 只，雄性，體質(zhì)量160～180 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滇）2015-0002。動(dòng)物購買后均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，每日明暗12 h 交替，溫度22～28℃，濕度40%～60%，自由飲食。

1.2 藥品與試劑93.6%的決明子蒽醌苷［7］（陜西元朗生物工程有限公司）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT，批號(hào)：29872201）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST，批號(hào)：29113801）、甘油三酯（triglyceride，TG，批號(hào)：33122201）和膽固醇（total cholesterol，TC，批號(hào)：34078601）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒（批號(hào)：MD115）和BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)：MD912022）購自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜、ACOX1（批號(hào)：SC-517306）、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A，批號(hào)：SC-393070）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，批號(hào)：SC-365062）抗體均購自美國Santa公司；二抗（北京中杉金橋生物科技公司，批號(hào)：ZF-0311）；戊巴比妥（江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，批號(hào)：76-74-4）；增強(qiáng)型ECL 發(fā)光試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；膠片（中國樂凱集團(tuán)有限公司）；引物由上海英俊公司設(shè)計(jì)并生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海喆圖儀器有限公司）；-86℃冰箱（美的公司）；普通冰箱（海爾公司）；分光光度計(jì)（上海美析儀器公司）；酶標(biāo)儀和高速冷凍離心機(jī)（賽伯樂儀器有限公司）；蛋白電泳儀（美國伯樂公司）；GelTower 簡約型凝膠成像儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；RT-qRCR 儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、造模、治療和處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)10 天后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為6組，即正常組（普通飼料喂養(yǎng)8 周+1 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃8 周）、模型組［高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周+1 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃8 周］、陽性藥物組［高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周+23 mg/（kg·d）多烯磷脂酰膽堿灌胃8 周］、決明子蒽醌苷低劑量組［高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周+5 mg/（kg·d）決明子蒽醌苷灌胃8 周］、中劑量組［高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周+10 mg/（kg·d）決明子蒽醌苷灌胃8周］和高劑量組［高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周+20 mg/（kg·d）決明子蒽醌苷灌胃8周］。結(jié)束后全部大鼠分批次禁食12 h過夜，于次日采用3%的戊巴比妥（0.2 mL/kg）腹腔注射麻醉，心臟取血，最后取出肝臟組織行病理學(xué)檢測（取肝左葉約1/4 置于4%的中性福爾馬林溶液中保存，其余置于超低溫冰箱中保存）。

1.4.2 血清 ALT、AST 及 TG、TC 測定 血液收集后，冰水中放置10 min，后采用低溫高速離心機(jī)離心半徑 5 cm，3000 r/min 離心 10 min，收集血清，按照試劑盒說明測定血清ALT、AST、TG及TC水平。

1.4.3 組織病理學(xué)檢測 從4%的中性福爾馬林溶液中取出肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，光鏡下觀察，計(jì)算機(jī)彩色成相系統(tǒng)照相。

1.4.4 ACOX1 和CPT1A 蛋白觀察 采用免疫印跡法（Western Blotting）檢測肝臟組織中ACOX1和CPT1A 蛋白表達(dá)。精確稱取肝臟組織100 mg，加入1 mL 的總蛋白提取液，勻漿后離心半徑5 cm，4000 r/mim 離心15 mim，離心后收集上清，定量調(diào)平后，每組各取60 μg行SDS-PAGE 電泳，完成后半干轉(zhuǎn)移法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，取出PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉2 h，PBST洗滌3次后加入一抗過夜，次日PBST再次洗滌3 次后加入二抗，1 h 后PBST洗滌3次，暗室曝光洗片，收集圖像，采用Image J 計(jì)算各條帶灰度值，結(jié)果以所測蛋白的灰度值與GAPDH灰度值的比值表示。

1.4.5 ACOX1 和 CPT1A 的 mRNA 檢測 每組各取30 mg 肝臟組織，用天根總RNA 提取試劑盒提取總RNA，提取后定量調(diào)平，按照試劑盒說明書各逆轉(zhuǎn)錄cDNA，完成后以cDNA 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）檢測，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 s、退火：60℃30 s、72℃延伸 35 s，循環(huán)次數(shù) 34 次，最后72℃條件下再延伸5 min。計(jì)算方法為2-ΔΔCT。以各基因所測值與正常組的比值作為該基因的相對表達(dá)量。

CPT1A 引 物 設(shè) 計(jì) ，上游 ：5′-ATGACGGCTATGGTGTCTCC-3′，下游：5′-GTGAGGCCAAACAAGGTGAT-3′；ACOX1引物設(shè)計(jì)為，上游：5′-CTTGTTCGCGCAAGTGAGG-3′，下游：5′-CAGGATCCGACTGTTTACC-3′；GAPDH 引物設(shè)計(jì)為，上游：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能與正常組比較，模型組大鼠AST 和ALT 升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和決明子蒽醌苷3 個(gè)劑量組AST 和ALT 均降低（P＜0.05），決明子蒽醌苷高劑量組低于陽性藥物組（P＜0.05），見表1。

2.2 血脂與正常組相比，模型組大鼠血清中TG和TC升高（P＜0.05），與模型組比較，陽性藥物組和決明子蒽醌苷3 個(gè)劑量組TG 和TC 均降低（P＜0.05），決明子蒽醌苷高劑量組低于陽性藥物組（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠AST和ALT比較（） U/L

表1 各組大鼠AST和ALT比較（） U/L

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽性藥物組比較，P＜0.05

ALT 30.56±5.13 56.78±8.98 41.29±7.24*#45.66±7.76*#42.39±6.97*#36.75±5.83*#△組別正常組模型組陽性藥物組決明子蒽醌苷低劑量組決明子蒽醌苷中劑量組決明子蒽醌苷高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 AST 44.67±6.54 76.35±9.63 53.92±7.08*#60.32±7.74*#55.94±6.58*#48.90±5.97*#△

表2 各組大鼠TG和TC比較（） mmol/g

表2 各組大鼠TG和TC比較（） mmol/g

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽性藥物組比較，P＜0.05

TC 1.12±0.13 3.34±0.23*2.42±0.34*#2.70±0.29*#2.41±0.27*#2.10±0.32*#△組別正常組模型組陽性藥物組決明子蒽醌苷低劑量組決明子蒽醌苷中劑量組決明子蒽醌苷高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 TG 0.12±0.04 0.82±0.12*0.59±0.09*#0.67±0.08*#0.61±0.13*#0.50±0.07*#△

2.3 HE 染色正常組大鼠肝細(xì)胞核分布均勻，大小均已，無脂肪空泡；模型組出現(xiàn)明顯的脂肪空泡，細(xì)胞核大小不一致，且呈明顯的炎癥反應(yīng)；決明子蒽醌苷3 個(gè)劑量組脂肪顆粒數(shù)量均呈不同程度減少，炎癥反應(yīng)減輕，高劑量組幾乎看不到任何脂肪空泡；陽性藥物組和高劑量基本一致，幾乎看不到任何脂肪空泡。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織（HE，×400）

2.4 大鼠ACOX1和CPT1A蛋白表達(dá)與正常組相比，模型組、陽性藥物組和決明子蒽醌苷3 個(gè)劑量組大鼠肝臟組織中ACOX1 和CPT1A 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），決明子蒽醌苷低劑量和中劑量組以及陽性藥物組基本一致，高劑量組高于陽性藥物組（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肝臟組織中ACOX1和CPT1A Western blotting結(jié)果

表3 各組大鼠肝臟組織中ACOX1和CPT1A蛋白相對表達(dá)量（）

表3 各組大鼠肝臟組織中ACOX1和CPT1A蛋白相對表達(dá)量（）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽性藥物組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性藥物組決明子蒽醌苷低劑量組決明子蒽醌苷中劑量組決明子蒽醌苷高劑量組CPT1A/GAPDH 1.14±0.17 0.28±0.08*0.49±0.07*#0.46±0.05*#0.48±0.03*#0.62±0.04*#△鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 ACOX1/GAPDH 0.82±0.12 0.14±0.03*0.45±0.06*#0.42±0.06*#0.46±0.05*#0.57±0.06*#△

2.5 大鼠ACOX1 和CPT1A 的mRNA 表達(dá)與正常組相比，模型組、陽性藥物組和決明子蒽醌苷3 個(gè)劑量組大鼠肝臟組織中ACOX1 和CPT1A 的mRNA 表達(dá)均降低（P＜0.05），決明子蒽醌苷低劑量和中劑量組以及陽性藥物組基本一致，高劑量組高于陽性藥物組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肝臟組織中ACOX1和CPT1A的mRNA相對表達(dá)量（）

表4 各組大鼠肝臟組織中ACOX1和CPT1A的mRNA相對表達(dá)量（）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽性藥物組比較，P＜0.05

CPT1A mRNA 1.00±0.00 0.37±0.07*0.55±0.04*#0.56±0.03*#0.58±0.06*#0.65±0.06*#△組別正常組模型組陽性藥物組決明子蒽醌苷低劑量組決明子蒽醌苷中劑量組決明子蒽醌苷高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 ACOX1 mRNA 1.00±0.00 0.29±0.05*0.52±0.07*#0.54±0.06*#0.56±0.09*#0.72±0.011*#△

3 討論

決明子別名草決明、鈍葉決明、馬蹄決明、假綠豆等，主要產(chǎn)于我國河南、四川、安徽等地。是藥食兩用品［7］。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有其藥理活性的詳細(xì)記錄，《本草綱目》中記載，決明子味甘、苦、咸，有除肝膽風(fēng)熱，淫膚白膜，青盲的作用；《本草正義》中認(rèn)為決明子明目，可滋益肝腎，潤腸通便，是培本之正治［8］?，F(xiàn)代中醫(yī)對其進(jìn)行了完善，認(rèn)為決明子除護(hù)肝明目、通便功效外，還有多種藥理活性，如劉菊秀等［9］研究報(bào)道決明子具有降血壓作用；何菊英等［10］研究顯示決明子具有降血脂作用；閻君寶等［11］報(bào)道決明子可以抑制營養(yǎng)性肥胖大鼠體質(zhì)量增加等。之后許多學(xué)者［12-14］研究結(jié)果提示，發(fā)揮降壓和調(diào)節(jié)血脂等多種生物活性的主要為決明子蒽醌、吡酮和脂肪酸類等，其中又以決明子蒽醌苷活性最高。為此本研究采用決明子蒽醌苷治療模型大鼠NAFLD。

高脂高糖飲食構(gòu)建的NAFLD 大鼠模型最大的特點(diǎn)為血脂和肝功能異常，而已有文獻(xiàn)證實(shí)決明子提取物對血脂和肝功能具有明顯作用，如決明子水提物對小鼠高血脂具有明顯降低作用，作用機(jī)理與其降低血清 TC 和 TG 密切相關(guān)［15］。還有學(xué)者［16］構(gòu)建了CCl4致肝功能損傷模型，發(fā)現(xiàn)蒽醌類可以改善大鼠肝功能指標(biāo)血清ALT、ALP 和AST 等的含量。本研究中采用高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD大鼠模型，結(jié)果顯示與正常組相比，模型組AST、ALT、TG 和TC 均升高。此外，大鼠肝臟病理學(xué)顯示，模型組大鼠有明顯的脂肪空泡和炎癥反應(yīng)，證明NAFLD 模型構(gòu)建成功；之后采用決明子蒽醌苷干預(yù)，研究結(jié)果和上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，決明子蒽醌類化合物可以改善大鼠肝功能，降低血脂。

NAFLD 發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、ROS等［17-20］，但無論哪種發(fā)病機(jī)制，都涉及脂肪酸氧化，脂肪酸氧化主要有α、β和ω3 種方式，其中α氧化主要涉及脂肪酸的合成，β氧化為體內(nèi)主要脂肪酸分解過程，其代謝酶活性的高低決定肝臟脂肪的排出，在脂酸β 氧化中，線粒體是主要活動(dòng)場所［21］。正常情況下，人體攝入的脂酸可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)活化為脂酰輔酶A，然后脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體在脂肪酸β氧化相關(guān)酶的作用下分解釋放能量供機(jī)體利用。脂酰輔酶A 由于分子量較大，不能直接進(jìn)入線粒體，此時(shí)需要和肉堿結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)，CPT1A 是催化脂酰輔酶A 結(jié)合的酶，因此其含量的高低直接決定長鏈脂肪酸是進(jìn)入線粒體還是存儲(chǔ)于胞質(zhì)［22］。在脂肪酸進(jìn)入線粒體后，β氧化酶系之一ACOX1 又在其中占有重要地位，ACOX1 是過氧化體氧化增殖的標(biāo)志，有研究［23］顯示ACOX1基因敲除小鼠缺乏ACOX1，肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性和自發(fā)過氧化體增殖，進(jìn)一步證實(shí)了ACOX1 在 NAFLD 中的作用 ，因此本研究以 CPT1A 和ACOX1 為靶點(diǎn)，考察決明子蒽醌苷對其的作用，本研究結(jié)果顯示，決明子蒽醌苷可以增加NAFLD 大鼠肝臟中CPT1A與ACOX1蛋白和mRNA的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，NAFLD 大鼠肝功能明顯異常，決明子蒽醌苷可以改善肝功能，降低血脂，這可能與決明子蒽醌苷可以上調(diào)脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶CPT1A和ACOX1表達(dá)有關(guān)。