張自陽，王 斌，王智煜，王志偉，朱啟迪，茹振鋼，劉明久

(河南科技學(xué)院,河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

春季低溫(倒春寒)一直是黃淮及長(zhǎng)江中下游流域冬小麥生產(chǎn)的主要?dú)庀鬄?zāi)害之一。近年來，倒春寒頻繁發(fā)生[1]。從1981-2019年的28 a間，中國主要小麥產(chǎn)區(qū)共發(fā)生了14次倒春寒，頻率高達(dá)50%。低溫幾乎影響植物生理生化的所有方面[2]。雌雄蕊原基分化期是小麥低溫敏感時(shí)期[3]，該發(fā)育時(shí)期如遇倒春寒會(huì)直接影響小麥幼穗發(fā)育，造成穗數(shù)、穗粒數(shù)嚴(yán)重下降，對(duì)產(chǎn)量造成不可估量的損失[4-5]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，小麥對(duì)低溫脅迫的耐受機(jī)制研究逐漸從表型[3，6-8]和生理生化水平[3，9-10]轉(zhuǎn)到分子水平[11-16]。目前，小麥抗低溫耐受機(jī)制的研究主要集中在越冬前的苗期，但研究表明小麥苗期抗凍性與春季生殖生長(zhǎng)階段抗凍性沒有顯著相關(guān)性[17]。頻繁的倒春寒災(zāi)害迫切需要開展小麥抗倒春寒的相關(guān)機(jī)制研究。倒春寒對(duì)小麥的影響相關(guān)研究目前主要是低溫脅迫下表型與生理生化機(jī)制的研究[3，8，18]，對(duì)于倒春寒脅迫響應(yīng)基因的克隆、功能鑒定以及抗倒春寒基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制等方面研究較少。

microRNA(miRNA)是一種典型的小非編碼RNA，可指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，在各種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括發(fā)育、激素反應(yīng)和應(yīng)激適應(yīng)[19-21]。自Sunkar等[22]首次證明了miRNA參與低溫應(yīng)激的調(diào)節(jié)以來，近年來許多研究也證實(shí)了植物miRNA在寒冷脅迫反應(yīng)中的作用[23-26]。擬南芥中共鑒定出16種miRNA與低溫脅迫有關(guān)[22，27-28]。小麥幼苗中miR159、miR164、miR169、miR319、miR398、miR1029和miR1126具有低溫響應(yīng)性[24]。雖然對(duì)于miRNA調(diào)控小麥抗低溫研究已有報(bào)道，但對(duì)miRNA在小麥應(yīng)對(duì)低溫脅迫中的作用認(rèn)識(shí)仍然有限，對(duì)于miRNA調(diào)控倒春寒的作用機(jī)制仍不明確。鑒于此，前期篩選的2個(gè)抗倒春寒能力有顯著差異的小麥品種為材料[3]，在雌雄蕊原基分化期進(jìn)行低溫脅迫處理，利用RNA-seq技術(shù)，獲得抗倒春寒能力不同的小麥品種幼穗miRNA表達(dá)譜，采用psRobot(v1.2)進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)，解析差異表達(dá)miRNA在低溫脅迫中的作用，為深入研究小麥抗倒春寒脅迫的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥材料為矮抗58(AK58，抗倒春寒)、鄭麥366(ZM366，不抗倒春寒)，均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2017-2018年在河南省新鄉(xiāng)市河南科技學(xué)院試驗(yàn)田進(jìn)行。采用盆栽方法種植，10月10日播種，播種后將盆埋入大田，盆內(nèi)土壤與盆外大田齊平。三葉期定苗，每盆留苗10株。2個(gè)品種分別設(shè)對(duì)照和低溫處理2組，每組15盆。同時(shí)，另外播種5盆用于取樣鏡檢跟蹤幼穗發(fā)育進(jìn)程觀察。低溫處理參照張自陽等[3]的方法進(jìn)行，從小麥越冬起身之后，每隔2 d選取主莖和分蘗，調(diào)查AK58、ZM366幼穗發(fā)育進(jìn)程，待2個(gè)小麥品種發(fā)育到穎片原基分化期后，將材料移至人工氣候室中生長(zhǎng)(氣候室設(shè)置溫度為白天22 ℃，夜晚13 ℃)。小麥生長(zhǎng)發(fā)育至雌雄蕊原基分化期后，分別將低溫處理的AK58(AKYJC)、ZM366(ZMYJC)移入人工氣候箱中(人工氣候箱白天溫度0 ℃、濕度70%、時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度30 000 lx；夜晚溫度0 ℃，濕度70%，時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度0 lx)進(jìn)行低溫處理72 h。以人工氣候室中的AK58(AKYJCK)、ZM366(ZMYJCK)為對(duì)照。處理結(jié)束后，將低溫處理的材料分為兩部分，一部分移至人工氣候室繼續(xù)生長(zhǎng)，用于調(diào)查結(jié)實(shí)情況。另一部分取幼穗用于miRNA測(cè)序，幼穗樣品按0.5 g分裝于凍存管中，迅速用液氮冷凍，-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩＝Y(jié)實(shí)率=低溫處理結(jié)實(shí)粒數(shù)/正常對(duì)照結(jié)實(shí)粒數(shù)×100%。

1.2.2 總RNA提取、RNA樣品的完整性和濃度測(cè)定 將凍存在-80 ℃的雌雄蕊原基分化期的幼穗組織取出，用TRIzol reagent(Invitrogen，CA，USA)試劑盒提取總RNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，凱奧K5500分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，用安捷倫2100檢測(cè)樣品RNA的完整性和濃度。

1.2.3 小RNA文庫構(gòu)建和Illumina測(cè)序 委托安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司完成小RNA文庫構(gòu)建和Illumina測(cè)序?？俁NA樣本檢測(cè)合格后，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立測(cè)序文庫。采用SE50測(cè)序策略[29]對(duì)檢驗(yàn)合格的測(cè)序文庫進(jìn)行Illumina HiSeq高通量測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析 首先將原始序列過濾得到的Clean reads通過Bowtie(1.1.2版)與中國春基因組(http：//www. ensembl. org/index. html)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(Release 21)中的基因組注釋信息，將Clean reads在基因組中的比對(duì)信息和miRNA的定位信息進(jìn)行匹配(100%的位置重疊)[30]，鑒定已知miRNA，并計(jì)算RPM(Reads per million)值。利用軟件DEGseq對(duì)AK58 與ZM366差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析，篩選條件為padj<0.05且|log2(Fold_change)|≥1[31]，找出差異表達(dá)的miRNA。采用psRobot(v1.2)[32]對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO(Gene ontology，http：//geneontology.org/)和KEGG功能注釋分析。以P<0.05為閾值，篩選顯著富集的GO term，以P<0.01篩選顯著富集代謝通路(Pathway)。

1.2.5 差異表達(dá)miRNA的RT-PCR質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)AK58和ZM366對(duì)照和低溫處理幼穗中差異表達(dá)miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以U6為內(nèi)參，利用miRNA cDNA synthesis kit(天根生化科技有限公司，北京)對(duì)樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系包括Nuclease-free water(6.8 μL)、上游引物(0.4 μL)、下游引物(0.4 μL)、qPCR Master Mix(10 μL)、樣品2 μL、miRNA第一鏈cDNA 0.4 μL，構(gòu)成總體積為20 μL反應(yīng)體系。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性40 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s，72 ℃ 25 s，46個(gè)PCR 循環(huán)；采用默認(rèn)設(shè)置自動(dòng)生成Ct值。RT-PCR驗(yàn)證的miRNA及其引物列于表1中，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

表1 熒光定量引物列表Tab.1 The list of primers of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)矮抗58、鄭麥366穗子表型特征及結(jié)實(shí)率的影響

雌雄蕊原基低溫脅迫72 h，AK58穗形受到輕微影響(圖1-A，AKYJC)，而ZM366的穗形受影響較大，出現(xiàn)結(jié)實(shí)率極低的穗子(圖1-A，ZMYJC-1)、光稈穗(圖1-A，ZMYJC-2)。低溫處理后，AK58和ZM366的結(jié)實(shí)率分別比對(duì)照下降12%,89%(圖1-B)，說明雌蕊原基分化期低溫脅迫對(duì)2個(gè)小麥品種均有影響，但對(duì)ZM366的影響較大。

2.2 矮抗58、鄭麥366小麥幼穗高通量測(cè)序數(shù)據(jù)過濾分析

對(duì)低溫處理72 h的小麥幼穗測(cè)序文庫進(jìn)行Illumina測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(表2)，AK58共得到66 327 682條Raw reads，經(jīng)過濾后得到45 301 441條Clean reads，ZM366共得到59 337 012條Raw reads，過濾后得到45 396 985條Clean reads。過濾掉17 bp以下的reads，大多數(shù)reads長(zhǎng)度分布在23～25 nt(圖2)，AK58、ZM366雌雄蕊原基分化期低溫處理幼穗中24 nt reads分別占總reads的71.48%，72.96%，AK58、ZM366雌雄蕊分化期對(duì)照幼穗中24 nt reads分別占總reads的61.88%，68.64%。

表2 矮抗、鄭麥366小麥幼穗測(cè)序原始數(shù)據(jù)過濾情況Tab.2 Filtering of the original data of young spike sequencing of AK58 and ZM366

2.3 矮抗58、鄭麥366 幼穗Clean reads與參考序列比對(duì)分析

將過濾后得到的17～30 nt Clean reads通過基因組比對(duì)分析軟件與參考序列進(jìn)行比對(duì)(表3)，AKYJC、AKYJCK、ZMYJC、ZMYJCK分別有16 454 955，17 878 373，17 544 621，18 919 501條序列可以完全匹配到基因組上，分別占Clean reads的80.69%，80.01%，72.66%，85.74%。

表3 矮抗58、鄭麥366低溫脅迫與對(duì)照幼穗中 Clean reads與參考序列比對(duì)Tab.3 Comparison of Clean reads with reference sequence in young panicles of AK58 and ZM366 under low temperature stress and control

2.4 已知miRNA鑒定

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(Release 21)中的基因組注釋信息，共鑒定到112類miRNA，分屬于38個(gè)不同的MIRNA家族。一般來說，miRNAs由保守和物種特異的miRNAs組成。保守miRNAs在植物發(fā)育和逆境反應(yīng)中具有重要作用。以短柄草、水稻、玉米、擬南芥為參照物種進(jìn)行同源搜索，識(shí)別小麥中MIRNA家族同源性，發(fā)現(xiàn)16個(gè)MIRNA家族在小麥中特異表達(dá)。12個(gè)MIRNA家族在以上4個(gè)物種中保守，3個(gè)MIRNA家族在以上3個(gè)物種中保守，1個(gè)MIRNA家族在以上2個(gè)物種中保守，6個(gè)MIRNA家族在1個(gè)物種中保守。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些已知但不保守的MIRNA家族，如MIR9654、MIR9657、MIR9662、MIR9666、MIR3522，表明他們可能參與小麥幼穗的形成。

2.5 矮抗58、鄭麥366低溫脅迫與對(duì)照幼穗組織中差異表達(dá)miRNA分析

利用軟件DEGseq將獲得的已知miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，與對(duì)照相比，低溫處理后AK58共鑒定出85個(gè)差異表達(dá)miRNA，ZM366共鑒定出88個(gè)差異表達(dá)miRNA(圖3)。設(shè)定差異顯著表達(dá)miRNA的篩選條件為padj<0.05、|log2(Fold_change)|≥1，AK58共鑒定出27個(gè)miRNA表達(dá)差異顯著(圖4，AK58)，其中23個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)，4個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)，差異表達(dá)極顯著的miRNA為2個(gè)，分別是tae-miR9672b、tae-miR9672a-3p。ZM366共鑒定出48個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNA(圖4，ZM366)，13個(gè)上調(diào)表達(dá)，35個(gè)下調(diào)表達(dá)。差異表達(dá)極顯著的miRNA為4個(gè)，分別為tae-miR9672b、tae-miR9672a-3p、tae-miR6201、tae-miR9674b-5p。

低溫脅迫后tae-miR9777、tae-miR9653b、tae-miR531在AK58和ZM366幼穗中均顯著上調(diào)表達(dá)。tae-miR9666a-3p、tae-miR5062-5p、tae-miR171a、tae-miR9668-5p、tae-miR9670-3p、tae-miR9772、tae-miR9677a、tae-miR9657b-3p、tae-miR9657c-3p、tae-miR9663-5p、tae-miR9661-5p、tae-miR1131在低溫脅迫的AK58幼穗中上調(diào)表達(dá)，但在低溫脅迫的ZM366幼穗中下調(diào)表達(dá)。tae-miR9672b、tae-miR9672a-3p、tae-miR9774在低溫脅迫的AK58幼穗中下調(diào)表達(dá)，而在低溫脅迫的ZM366幼穗中上調(diào)表達(dá)。tae-miR156、tae-miR398在低溫脅迫的ZM366幼穗中顯著上調(diào)表達(dá)，而在低溫脅迫的AK58幼穗中表達(dá)無差異或下降。與對(duì)照相比，低溫脅迫后AK58有9條miRNA(圖4，AK58)，ZM366有30條miRNA分別在各自幼穗中特異顯著表達(dá)(圖4，ZM366)。

2.6 低溫脅迫下矮抗58、鄭麥366差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)及GO功能分析

miRNA通過與靶基因上的特定區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合特定蛋白質(zhì)從而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄或者翻譯過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。利用psRobot(v1.2)對(duì)低溫脅迫下AK58、ZM366差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，AK58幼穗中差異表達(dá)的85個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)848個(gè)靶基因，每個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因3～144個(gè)不等；ZM366幼穗中88個(gè)差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)6 537個(gè)靶基因。每個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因3～913個(gè)不等，靶基因最多的為tae-miR531，共預(yù)測(cè)到了136個(gè)靶基因。

為了更好地理解這些差異表達(dá)顯著miRNA的功能，對(duì)低溫脅迫下AK58幼穗中848個(gè)靶基因，ZM366幼穗中5 376個(gè)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，AK58差異表達(dá)miRNA靶基因有20個(gè)生物學(xué)過程、6個(gè)細(xì)胞成分、6個(gè)分子功能類別極顯著富集(FDR<0.01)；ZM366有10個(gè)生物學(xué)過程、14個(gè)細(xì)胞成分、19個(gè)分子功能類別顯著富集(FDR<0.01)(圖5)?？梢姡町恗iRNA靶基因廣泛涉及GO功能分類中的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過程3大類別，AK58共涉及32個(gè)小類別，ZM366共涉及43個(gè)小類別。AK58中涉及較多的條目分別是細(xì)胞發(fā)育過程[GO：0048869](44個(gè)基因)、細(xì)胞分化[GO：0030154](42個(gè)基因)、細(xì)胞分裂[GO：0051301](31個(gè)基因)、細(xì)胞分裂[GO：0048468](27個(gè)基因)、蛋白質(zhì)復(fù)合物[GO：0043234](78個(gè)基因)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物[GO：1990234](27個(gè)基因)、大分子絡(luò)合物[GO：0032991](92個(gè)基因)、DNA結(jié)合[GO：0003677](86個(gè)基因)；ZM366涉及的較多的條目是固有免疫應(yīng)答[GO：0002376](160個(gè)基因)、程序性細(xì)胞死亡[GO：0012501](131個(gè)基因)、防御反應(yīng)[GO：0006952](387個(gè)基因)、細(xì)胞對(duì)脅迫的反應(yīng)[GO：0033554](256個(gè)基因)、線粒體(GO：0005739)(222個(gè)基因)、細(xì)胞器腔[GO：0043233](213個(gè)基因)、細(xì)胞核部件[GO：0044428](237個(gè)基因)、小分子結(jié)合[GO：0036094](799個(gè)基因)、碳水化合物衍生物結(jié)合[GO：0097367](705個(gè)基因)、嘌呤核苷酸結(jié)合[GO：0017076](691個(gè)基因)、核糖核苷酸結(jié)合[GO：0032553](698個(gè)基因)、陰離子結(jié)合[GO：0043168](780個(gè)基因)?？梢钥闯?，低溫對(duì)2個(gè)小麥品種的影響不同。低溫脅迫下，AK58幼穗中差異表達(dá)miRNA靶基因大多數(shù)富集在生物學(xué)過程，而ZM366差異表達(dá)miRNA靶基因富集在分子功能，說明低溫主要影響AK58生物學(xué)過程，影響ZM366幼穗抵御低溫的分子功能。

進(jìn)一步對(duì)2個(gè)小麥品種幼穗中差異表達(dá)miRNA進(jìn)行KEGG代謝通路(Pathway)富集分析，結(jié)果顯示，AK58差異表達(dá)miRNA靶基因顯著富集(P<0.05)到萜類、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，RNA聚合酶，核糖體，嘧啶代謝，嘌呤代謝，核苷酸切除修復(fù)，煙酸和煙酰胺代謝，錯(cuò)配修復(fù)，DNA復(fù)制，原核生物固碳途徑，自噬11個(gè)Pathway(圖6)；ZM366差異表達(dá)miRNA靶基因顯著富集(P<0.05)在植物-病原互作，植物晝夜節(jié)律，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，細(xì)胞周期，苯丙氨酸代謝，苯丙烷生物合成，RNA聚合酶，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，氰胺酸代謝，次生代謝產(chǎn)物的生物合成，光合生物中碳固定，丙酮酸代謝，類胡蘿卜素生物合成13個(gè)代謝通路(圖6)。

miRNA調(diào)控mRNA參與小麥應(yīng)答低溫脅迫植物晝夜節(jié)律代謝途徑中，miRNA調(diào)控光形態(tài)建成轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和開花過程的靶基因表達(dá)模式不同。在光形態(tài)建成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ZM366幼穗中tae-miR1127a、tae-miR1130b-3p作用于PRR5基因，上調(diào)了PRR5基因的表達(dá)，tae-miR1122c-3p、tae-miR1128作用于CRY1和CRY2基因，上調(diào)了CRY1和CRY2基因的表達(dá)。同時(shí)，tae-miR6197-5p、tae-miR1128、tae-miR1127a、tae-miR1120b-3p、tae-miR5200分別上調(diào)RFWD2、SPA1、HY5、CSNK2B、FT的基因表達(dá)。而在AK58中無變化。2個(gè)小麥品種miRNA參與低溫應(yīng)激反應(yīng)phyA和phyB介導(dǎo)的遠(yuǎn)紅光和紅光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，AK58和ZM366均上調(diào)了PRR5基因的表達(dá)，但CSNK2B基因在ZM366中上調(diào)表達(dá)，在AK58中變化不明顯(圖7)。

2.7 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行了qRT-PCR，分析miRNA的表達(dá)。基于高通量測(cè)序結(jié)果，使用10個(gè)代表不同測(cè)序數(shù)據(jù)表達(dá)水平miRNA(包括5個(gè)AK58的miRNA和5個(gè)ZM366的miRNA)。對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)與qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)分別為0.978 4和0.940 7，說明RNA-seq數(shù)據(jù)與qRT-PCR數(shù)據(jù)呈正相關(guān)關(guān)系(圖8)。miRNA表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果相似，說明miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)是有價(jià)值的。

3 結(jié)論與討論

miRNA在植物對(duì)生物和非生物脅迫的適應(yīng)反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)功能[21-33]。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子，已被檢測(cè)出單獨(dú)或與多種miRNA協(xié)同對(duì)環(huán)境脅迫做出反應(yīng)[21]。大量研究證明，miRNA在不同植物體內(nèi)參與對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)[34-35]。低溫脅迫后大量的miRNA在葡萄[36]、水稻[37]、小麥[24，38]、大麥[39]、棉花[40]、煙草[41]等植物中差異表達(dá)。說明miRNA可能在低溫脅迫耐受調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著特殊作用。本研究用低溫脅迫后2個(gè)抗倒春寒能力不同的小麥品種構(gòu)建了4個(gè)miRNA文庫，試圖找到小麥參與倒春寒脅迫響應(yīng)的miRNAs。結(jié)果表明，低溫脅迫下2個(gè)小麥品種幼穗中均有大量miRNA差異表達(dá)，這與Song等[38]的研究結(jié)果相似，AK58鑒定出85個(gè)差異表達(dá)miRNA，27個(gè)miRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著差異；ZM366鑒定出88個(gè)差異表達(dá)miRNA，48個(gè)miRNA表達(dá)差異顯著，說明差異表達(dá)的miRNA介導(dǎo)的分子途徑響應(yīng)了AK58和ZM366的春季低溫脅迫。

同一植物品種的不同基因型對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)能力也可能不同，從低溫處理后AK58和ZM366的穗子表型和結(jié)實(shí)率可以看出，AK58抗倒春寒能力強(qiáng)于ZM366。2個(gè)小麥品種雌雄蕊原基分化期低溫處理后，tae-miR9666a-3p、tae-miR5062-5p、tae-miR171a、tae-miR9668-5p、tae-miR9670-3p、tae-miR9772、tae-miR9677a、tae-miR9657b-3p、tae-miR9657c-3p、tae-miR9663-5p、tae-miR9661-5p、tae-miR113在AK58幼穗中上調(diào)表達(dá)，但在ZM366的幼穗中下調(diào)表達(dá)。tae-miR9672b、tae-miR9672a-3p、tae-miR9774在低溫脅迫的AK58幼穗中下調(diào)表達(dá)，而在低溫脅迫的ZM366幼穗中上調(diào)表達(dá)。說明相同miRNAs對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)在同種植物不同基因型間不一致。AK58中上調(diào)和下調(diào)的miRNA可能與低溫脅迫響應(yīng)關(guān)系密切，可能通過調(diào)節(jié)代謝途徑對(duì)低溫脅迫做出反應(yīng)。值得注意的是，miRNA171a在抗倒春寒能力不同的小麥品種幼穗中出現(xiàn)相反的表達(dá)模式。miRNA171具有高度保守性[42]。miRNA171a是miRNA171的同源miRNA，屬于MIRNA171家族。在已有研究中，miRNA171參與調(diào)控番茄的株高[43]、大豆的育性[44]、小麥的抗鹽脅迫[45]。miRNA171在抗低溫的茶樹品種中上調(diào)表達(dá)，在低溫敏感的茶樹品種中下調(diào)表達(dá)[46]。本研究中，tae-miRNA171a在抗倒春寒能力強(qiáng)的AK58中顯著上調(diào)表達(dá)，而在抗倒春寒能力差的ZM366中顯著下調(diào)表達(dá)，與miRNA在低溫脅迫茶樹中的表達(dá)特征相似[46]，提示MIR171家族成員在低溫脅迫下可能具有不同的功能，miRNA171a高表達(dá)很可能增強(qiáng)了小麥幼穗的抗低溫能力。

值得注意的是，低溫脅迫下miRNA156在ZM366幼穗中顯著上調(diào)表達(dá)。研究表明，miR156在植物穗部生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。它通過負(fù)向調(diào)控TaSPL基因的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)小麥穗部生長(zhǎng)發(fā)育[47]。OsmiR156b和OsmiR156h在水稻中超表達(dá)導(dǎo)致開花推遲，穗分化枝數(shù)和小穗數(shù)減少[48]；小麥中超表達(dá)miRNA156會(huì)嚴(yán)重阻礙了穗部的生長(zhǎng)發(fā)育，平均穗節(jié)長(zhǎng)度和小穗數(shù)降低[49]。本研究表明，低溫脅迫后，miRNA156在ZM366中顯著上調(diào)表達(dá)，在AK58中表達(dá)變化不顯著。同時(shí)，ZM366低溫處理后出現(xiàn)光稈穗、空穗和結(jié)實(shí)率極低的穗。說明雌雄原基分化期低溫脅迫導(dǎo)致miRNA156在ZM366幼穗中的大量表達(dá)，miRNA156的超表達(dá)可能導(dǎo)致ZM366小花發(fā)育異常，進(jìn)而造成穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)嚴(yán)重下降。

miR398是ZM366幼穗中顯著上調(diào)表達(dá)的miRNA。已有研究表明，miR398在植物逆境應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用[50]。miR398對(duì)編碼Cu-Zn型超氧化物歧化酶(SOD)靶基因CSD剪切實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控。在小麥中通過抑制miRNA398表達(dá)增加CSDs水平清除體內(nèi)過多的ROS[45]。miR398與其靶基因表達(dá)之間的負(fù)調(diào)控關(guān)系在其他植物中也得到了證實(shí)[34，36]。當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時(shí)，為了保護(hù)自身機(jī)體，體內(nèi)的SOD會(huì)升高，以便清除過量ROS來保護(hù)自己。本研究表明，雌雄蕊原基分化期0 ℃低溫處理下，ZM366幼穗中miR398表達(dá)量顯著升高，而AK58中miR398表達(dá)量下降。miR398的大量表達(dá)可能會(huì)造成CSD基因(編碼SOD)表達(dá)量下降，SOD減少降低了ZM366的抗倒春寒能力。AK58幼穗中miR398表達(dá)量下降，負(fù)調(diào)控CSD基因產(chǎn)生大量的SOD來抵抗低溫脅迫。

miRNAs對(duì)低溫脅迫沒有直接的調(diào)節(jié)作用，而是通過與靶基因mRNA進(jìn)行反向互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)靶基因的剪切，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上充當(dāng)靶基因表達(dá)的調(diào)控因子。確定參與低溫反應(yīng)的靶基因?qū)τ诮沂緈iRNAs的調(diào)控功能非常重要。miRNA的上調(diào)表達(dá)與靶基因表達(dá)的減少有關(guān)，反之亦然。通過對(duì)低溫脅迫下AK58和ZM366差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及功能分析發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后AK58和ZM366幼穗中miRNA靶基因存在獨(dú)有的顯著富集代謝通路，AK58差異表達(dá)miRNA靶基因顯著富集在萜類、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，核糖體，嘧啶代謝，嘌呤代謝，核苷酸切除修復(fù)，煙酸和煙酰胺代謝，錯(cuò)配修復(fù)，DNA復(fù)制，原核生物固碳途徑，自噬等代謝通路；ZM366差異表達(dá)miRNA靶基因顯著富集在植物-病原互作，植物晝夜節(jié)律，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，細(xì)胞周期，苯丙氨酸代謝，苯丙烷生物合成，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，氰胺酸代謝，次生代謝產(chǎn)物的生物合成，光合生物中碳固定，丙酮酸代謝，類胡蘿卜素生物合成等代謝通路。靶基因富集的不同代謝通路表明，2個(gè)小麥品種在應(yīng)對(duì)倒春寒脅迫時(shí)可能采用了不同的調(diào)控方式。

植物晝夜節(jié)律鐘有助于耐旱和滲透脅迫，優(yōu)化其功能是一種潛在的作物改良策略。當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，它們的晝夜節(jié)律會(huì)發(fā)生變化[51]，使其能夠更好地應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化。當(dāng)晝夜節(jié)律功能異常時(shí)，植物對(duì)干旱、滲透脅迫、鹽度和低溫的耐受性發(fā)生改變[52]。晝夜節(jié)律通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的基因表達(dá)也會(huì)隨著冷熱的變化而變化[53]。晝夜節(jié)律振幅的變化和對(duì)低溫的反應(yīng)導(dǎo)致數(shù)千個(gè)基因表達(dá)的變化[54]。本研究表明，miRNA參與調(diào)控2個(gè)小麥品種應(yīng)答低溫脅迫，2個(gè)品種幼穗差異表達(dá)miRNA靶基因大量富集在植物晝夜節(jié)律代謝途徑。此外，植物晝夜節(jié)律途徑中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)模式也不同。植物中的光敏色素和隱花色素相互作用調(diào)控其光形態(tài)建成及光周期反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程[10，30-32]。CRY1、CRY2、RFWD2、SPA1、HY5、CSNK2B、FT是植物晝夜節(jié)律光形態(tài)建成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中光形態(tài)建成及光周期反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，低溫脅迫后CRY1、CRY2、RFWD2、SPA1、HY5、CSNK2B、FT在ZM366幼穗中均上調(diào)表達(dá)，而在AK58幼穗中變化不明顯。說明低溫脅迫下，ZM366幼穗中miRNA調(diào)控了光形態(tài)建成及光周期反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)，造成光形態(tài)建成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及開花調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，影響了小麥幼穗的生長(zhǎng)發(fā)育，這可能是2個(gè)小麥品種抗倒春寒能力不同的原因所在。

應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的方法對(duì)抗倒春寒能力不同的2個(gè)小麥品種幼穗的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行比較和分析，同時(shí)對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因功能進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)小麥抗倒春寒通過miRNA171a、miRNA156、miRNA398等多個(gè)miRNA的差異表達(dá)及多個(gè)與抗倒春寒相關(guān)的代謝通路協(xié)同作用抵抗倒春寒。研究結(jié)果提供了倒春寒脅迫下抗倒春寒能力不同的2個(gè)小麥品種幼穗在雌雄蕊原基分化期的miRNA表達(dá)譜及差異表達(dá)的信息，為闡明小麥抗倒春寒的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。該miRNA數(shù)據(jù)是小麥miRNA數(shù)據(jù)庫的重要補(bǔ)充，有助于了解小麥抗春季低溫脅迫的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。