張暢　周浮楊　鄭宇航　魏超越　王瓔珞　孫艷

【摘要】 目的：構(gòu)建人BATF2真核表達(dá)載體，并驗證其過表達(dá)對肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖的影響。方法：利用Trizol法提取正常人外周血單核細(xì)胞RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增出BATF2基因序列，再將其連接到pcDNA3.1真核表達(dá)載體上，采用酶切和測序的方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bel-7402細(xì)胞后，Western blot檢測BATF2蛋白表達(dá)變化，MTT法檢測對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：雙酶切和DNA測序結(jié)果驗證了pcDNA3.1-BATF2真核表達(dá)載體構(gòu)建成功;pc-DNA3.1-BATF2組BATF2蛋白表達(dá)量高于空白對照組與pcDNA3.1組（P<0.05）。轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，pc-DNA3.1-BATF2組Bel-7402細(xì)胞增殖的OD值均低于空白對照組和pcDNA3.1組（P<0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建pcDNA3.1-BATF2真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Bel-7402細(xì)胞后BATF2蛋白表達(dá)量增加，且過表達(dá)BATF2能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞增殖能力。

【關(guān)鍵詞】 BATF2 真核表達(dá)載體 Bel-7402細(xì)胞 細(xì)胞增殖

[Abstract] Objective： To construct the eukaryotic expression vector of human BATF2 and verify the effect of its overexpression on the proliferation of hepatoma Bel-7402 cells. Method： The RNA of normal human peripheral blood mononuclear cells was extracted by Trizol method and reverse transcribed into cDNA. The BATF2 gene was amplified by the cDNA template， and then linked to pcDNA3.1 eukaryotic expression vector. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transfected into Bel-7402 cells by the method of liposome transfection. After the recombinant plasmid was transfected into Bel-7402 cells by liposome transfection， the expression of BATF2 protein was detected by Western blot and the effect on cell proliferation was detected by MTT method. Result： The results of double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the eukaryotic expression vector pcDNA3.1-BATF2 was successfully constructed. The protein expression of BATF2 in pc-DNA3.1-BATF2 group was higher than those in blank control group and PCDNA3.1 group （P<0.05）. After transfection for 48， 72 and 96 h， the OD values of Bel-7402 cell proliferation in pcDNA3.1-BATF2 group were lower than those in blank control group and pcDNA3.1 group （P<0.05）. Conclusion： pcDNA3.1-BATF2 eukaryotic expression vector is successfully constructed and transfected into Bel-7402 cells to increase the expression of BATF2 protein， and the overexpression of BATF2 can significantly inhibit the proliferation ability of Bel-7402 cells.

[Key words] BATF2 Eukaryotic expression vector Bel-7402 cells Cell proliferation

First-author’s address： School of Basic Medical Science， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.19.007

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其具有高復(fù)發(fā)、高病死率等特點，嚴(yán)重危害患者的身心健康[1]。肝癌的發(fā)生與其他癌癥一樣，是一個多步驟、多因素共同作用所引起的復(fù)雜病理過程[2]?？茖W(xué)家們一直致力于挖掘肝癌的發(fā)病機制及其治療方法，而抗癌基因的研究一直是肝癌研究的熱點。堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子2（BATF2）是2008年由Su等[3]通過差減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其因結(jié)構(gòu)與激活轉(zhuǎn)錄因子ATF相似而得此命名。BATF2被檢測到在多種組織中廣泛表達(dá)，而在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下降或缺失，其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。目前關(guān)于BATF2與肝癌的相關(guān)報道相對較少，其在肝癌中的具體分子機制有待闡明。因此本研究構(gòu)建了pcDNA3.1-BATF2過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Bel-7402，以觀察BATF2對肝癌細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞株Bel-7402（購于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。儀器和試劑：電子天平（METTLER TOLEDO）、酶標(biāo)儀（瑞士Tecan）、低溫離心機（德國eppendorf）、BATF2抗體和GAPDH抗體（武漢三鷹）、羊抗兔二抗（Abacm）、MTT粉末（Sigma）、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone）、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning）、DMSO（Solarbio）。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-BATF2質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 利用Trizol法提取正常人外周血單核細(xì)胞RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板，利用高保真酶將BATF2全長序列通過PCR擴(kuò)增出來。BATF2引物序列包括：上游引物BATF2-F：5’-GCTCTAGAATGCACCTCTGTGGGGGCAATGG-3’（XbaI）;下游引物BATF2-R：CGGAATTCTTAGAAGTGGACTTGAGCAGAGGAG（EcoRI），片段大小為825 bp。擴(kuò)增條件：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳對目的基因進(jìn)行回收，利用XbaI和EcoRI對pcDNA3.1-HA空載體和目的基因進(jìn)行雙酶切，再一次通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收雙酶切片段。利用T4 DNA連接酶將目的基因連接到線性化的pcDNA3.1上，

16 ℃連接過夜。將連接后產(chǎn)物用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂布在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并將酶切開的質(zhì)粒測序。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃恒溫恒濕的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天換液1次。

1.2.3 pcDNA3.1-BATF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將5×105個/孔的Bel-7402細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)到90%融合度時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基。依照Lipofeetamine 3 000 Reagent說明書進(jìn)行pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-BATF2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

1.2.4 Western blot檢測BATF2蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。定量后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，然后加一抗37 ℃孵育5 h，TBST洗滌4次，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化細(xì)胞，5 000個/孔接種于96孔板中，細(xì)胞完全貼壁后每隔24 h使用MTT試劑對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測。檢測時，每孔加入20 μL MTT試劑，37 ℃孵育4 h，490 nm波長檢測OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BATF2載體的構(gòu)建及鑒定 提取pcDNA3.1-BATF2質(zhì)粒，經(jīng)XbaI和EcoRI雙酶切后可在832 bp處觀察到特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。雙酶切以及測序結(jié)果顯示pcDNA3.1-BATF2表達(dá)載體構(gòu)建成功。見圖1、2。

2.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BATF2質(zhì)粒后BATF2表達(dá)的鑒定 Western blot結(jié)果顯示，空白對照組BATF2相對表達(dá)量為（0.082±0.009），pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組BATF2相對表達(dá)量分別為（0.086±0.011）、（0.301±0.028）;pc-DNA3.1-BATF2組BATF2蛋白表達(dá)量高于空白對照組與pcDNA3.1組（P<0.05）。見圖3。

2.3 過表達(dá)BATF2對Bel-7402細(xì)胞增殖的影

響 MTT結(jié)果顯示，空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉(zhuǎn)染24 h后OD值分別為（0.354±0.012）、（0.346±0.021）和（0.337±0.017）;空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉(zhuǎn)染48 h后OD值分別為（0.685±0.024）、（0.712±0.019）和（0.614±0.019）;空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉(zhuǎn)染72 h后OD值分別為（0.912±0.026）、（0.866±0.028）和（0.712±0.023）;空白對照組、pcDNA3.1組和pc-DNA3.1-BATF2組轉(zhuǎn)染96 h后OD值分別為（1.014±0.031）、（0.995±0.034）和（0.753±0.025）。轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，pc-DNA3.1-BATF2組Bel-7402細(xì)胞增殖的OD值均低于空白對照組和pcDNA3.1組（P<0.05）。見圖4。

3 討論

肝癌已成為全球惡性腫瘤發(fā)病率第六位的腫瘤，其病死率更是排在了第四位，世衛(wèi)組織預(yù)測2030年全球范圍內(nèi)死于肝癌的人數(shù)將達(dá)到100多萬[5]。2018年全球新發(fā)肝癌病例約有84萬例，死亡病例約有78萬[6]。我國又是一個肝癌大國，肝癌患者的發(fā)病率和死亡率都超過了世界平均水平[7]。2018年我國新發(fā)肝癌病例約39萬，占全球肝癌新發(fā)病例的46.71%，死亡病例約37萬，占全球肝癌死亡病例的47.20%[6]。雖然近年來對肝癌的治療取得了巨大的進(jìn)展，但其仍然嚴(yán)重威脅著患者的健康和生命安全。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，伴隨著抑癌基因的失活和原癌基因的激活[7-8]。抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑癌基因能夠通過阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡來控制腫瘤細(xì)胞異常增殖，除此之外，某些抑癌基因還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抑癌的功能[9-12]。因此研究抑癌基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用對于肝癌的預(yù)防和治療具有重要意義。

BATF2基因由3個外顯子組成，共含有2 142個堿基對，其編碼274個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[13]。AP-1能夠調(diào)控正常細(xì)胞的癌性轉(zhuǎn)染，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，報道顯示，AP-1在90%以上的惡心腫瘤中存而BATF2能夠與AP-1結(jié)合，但由于其沒有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，使得AP-1不能起始轉(zhuǎn)錄，從而起到抑制AP-1活性的作用[14-16]。早期研究發(fā)現(xiàn)BATF2與前列腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性癌癥的發(fā)生和預(yù)后有著密切的關(guān)系，其在這些癌癥中常被檢測到表達(dá)缺失，而在這些癌癥對應(yīng)的正常細(xì)胞中卻被檢測到表達(dá)穩(wěn)定[17]。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn)BATF2表達(dá)陽性的肝癌患者平均生存時間顯著高于BATF2表達(dá)缺失的患者，并且BATF2表達(dá)與腫瘤分期和患者年齡具有相關(guān)性。Liu等[19]在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)BATF2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BATF2在抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的同時還能夠抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

目前國內(nèi)外關(guān)于BATF2在肝癌中的作用研究鮮有報道，本研究從正常人外周血單核細(xì)胞中調(diào)取了BATF2基因全長編碼序列，并連接到了pcDNA3.1真核表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-BATF2重組質(zhì)粒，并通過雙酶切法和測序法進(jìn)行了驗證。通過Lipofectamine 3 000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞Bel-7402后，經(jīng)Western Blot鑒定，轉(zhuǎn)染前后BATF2蛋白表達(dá)水平變化明顯，進(jìn)一步驗證了pcDNA3.1-BATF2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。薛龑等[20]研究發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染BATF2基因48 h后，過表達(dá)BATF2的人紅白血病Kasumi-1細(xì)胞增殖速度減慢，并且在72 h后與NC組細(xì)胞增殖速度出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。該發(fā)現(xiàn)與本研究一致，過表達(dá)BATF2同樣也能夠抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖，說明其在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但其具體作用機制還需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究證實了BATF2可以在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)僅僅是研究的前期準(zhǔn)備階段，下一步將更加深入的研究BATF2對肝癌增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為，力求闡明BATF2在肝癌中的作用及其具體機制。

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（收稿日期：2020-09-11） （本文編輯：田婧）