曾蕾，楊凱旋

腫瘤細胞由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血液成為循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs），這一概念由澳大利亞醫(yī)生ASHWORTH［1］在1869年首次提出。CTCs存在于血液循環(huán)系統(tǒng)中，可通過血液進行微轉(zhuǎn)移，是具有高活力、高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞，與腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來，CTCs作為新型生物標志物已成為各類腫瘤研究的熱點，在乳腺癌［2］、肺癌［3］、前列腺癌［4］、結(jié)直腸癌［5］等腫瘤診斷中得到了較為廣泛的應用。目前CTCs在腫瘤的早期診斷、實時個體化用藥指導，監(jiān)測腫瘤復發(fā)、闡明腫瘤耐藥機制以及改善臨床醫(yī)生對疾病進展和轉(zhuǎn)移的認識方面起著重要作用［6-8］，近年來，許多學者對CTCs在鼻咽癌的診斷與治療中的作用開展了大量研究。本文針對CTCs的特性、檢測方法、鑒定方法以及其在鼻咽癌中的研究進展做一綜述，以提高臨床醫(yī)生對CTCs的認識。

1 CTCs的特性

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散在早期發(fā)病時可能就已經(jīng)出現(xiàn)，而不是之前認為的是腫瘤后期的結(jié)果［9］，CTCs可在早期隨著血液循環(huán)到達并重新定殖于原發(fā)病灶或遠端器官，保持休眠狀態(tài)，在特定的條件刺激下釋放進入外周血液循環(huán)，最終發(fā)展成一個明顯的復發(fā)或轉(zhuǎn)移性病灶［10］。由于腫瘤細胞的異常增殖和代謝，其基因表達與修飾、蛋白合成與修飾以及某些極性顆粒物質(zhì)積聚發(fā)生異常，導致腫瘤細胞的大小、形態(tài)、介電屬性和細胞表面的標志蛋白均與正常細胞不同，是分離腫瘤細胞的理論基礎［11］。通常，CTCs與正常外周血細胞比較，具有核質(zhì)比大、體積大（白細胞直徑為8～10 μm，紅細胞為 8 μm，CTCs為 12～25 μm）、質(zhì)量重、密度高等特點。CTCs的細胞表面具有某些特異性的蛋白標志物，是與其他血細胞的區(qū)別。上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是腫瘤細胞特有的標志蛋白，在CTCs中特異性高表達，而在血細胞中不表達。此外，部分細胞角蛋白（cytokeratins，CKs），例如：CK6、CK18、CK19，也是其特異性標志物，但是CTCs不表達白細胞的表面標志蛋白CD45。因此，根據(jù)以上研究結(jié)果將CTCs的免疫組織學概念定義為細胞表面EpCAM（+）/CK（+）/CD45（-）的有核細胞。有研究在健康人體的血液中進行驗證，沒有發(fā)現(xiàn)具有相同免疫組織學特征的非惡性上皮細胞［12］，但在某些良性疾病患者血液中卻發(fā)現(xiàn)了具有相同免疫特性的細胞，如良性結(jié)腸病變［13］、胰腺病變［14］、良性乳腺疾病［15-16］等，表明有必要對CTCs進行進一步的分子表征分析。

在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細胞可與周圍環(huán)境發(fā)生作用，從上皮細胞轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細胞，這一過程稱為上皮 -間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 換（epithelial-mesenchymal transition，EMT），EMT使腫瘤細胞失去了上皮細胞的一些特性，如細胞間的黏附作用、細胞極性等，獲得了間質(zhì)細胞的一些特性，如運動、侵襲、抵抗凋亡等［17］。EMT使得腫瘤細胞的類型發(fā)生了改變，降解基質(zhì)的能力提高，細胞間的結(jié)合力減弱，因此轉(zhuǎn)換后的腫瘤細胞獲得了更強的轉(zhuǎn)移及侵襲能力，在血液中也更易存活［18］，且與腫瘤的抗藥性存在相關(guān)性［19］。通過EMT使CTCs獲得了腫瘤干細胞的自我更新、侵襲傾向和耐藥特性［20］，這可能是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵。EMT使腫瘤細胞脫離原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進而形成新的繼發(fā)轉(zhuǎn)移灶，因此EMT被認為是腫瘤細胞擴散至血液循環(huán)中的重要過程［21-25］。有新的證據(jù)表明，CTCs是高度異質(zhì)性的，包括上皮細胞表型、上皮與間質(zhì)細胞混合表型、間質(zhì)細胞表型以及循環(huán)腫瘤干細胞表型CTCs［26］。而由于發(fā)生了EMT，間質(zhì)細胞表型CTCs比其他類型的CTCs具有更強的轉(zhuǎn)移侵襲能力和耐藥性。此外，在一項乳腺癌研究中，對CTCs進行基因分析時發(fā)現(xiàn)外周血液中的CTCs與原發(fā)灶腫瘤細胞相比發(fā)生了基因變異，可能是因為CTCs在周圍環(huán)境影響下發(fā)生了自身適應性改變，與腫瘤的耐藥性具有一定的相關(guān)性，這也說明CTCs具有一定的基因突變能力［27］。CTCs的這些物理學及生物學特性是從外周血分離和富集CTCs的基礎。

2 CTCs的檢測

CTCs的檢測主要分為富集以及鑒定兩個部分，CTCs的數(shù)量在血液中處于極低水平，每106～107個外周血細胞才可能有1個CTCs，這就要求CTCs檢測技術(shù)不僅要有較高的靈敏度，以捕獲稀少的CTCs，同時也要有較高特異度，以排除外周血中的其余細胞，因此在上億個外周血細胞中分離富集得到CTCs較為困難，并且這也是CTCs計數(shù)及分子特征檢測的關(guān)鍵［28］。

2.1 CTCs的富集 根據(jù)CTCs的物理學及生物學特性，將CTCs的富集方法分為非特異性富集法及特異性富集法。非特異性富集法是指根據(jù)CTCs的密度、大小、表面電荷及可變形等性質(zhì)對CTCs進行分離富集，其中代表性方法的是膜過濾法和密度梯度離心法。膜過濾法依據(jù)CTCs直徑普遍大于血細胞直徑這一特性，用孔徑為8 μm大小的濾過膜分離血細胞從而得到CTCs，富集效果較好［29］。密度梯度離心法根據(jù)CTCs與其他外周血細胞密度的差異，通過相應的密度離心遞質(zhì)將CTCs與外周血細胞分離，但這種方法的特異度較低，得到的結(jié)果可信度欠佳，在臨床上使用較少。特異性富集法指利用特異性抗體與細胞表面抗原進行特異性結(jié)合來獲取CTCs（陽性分選法），或者去除血細胞而留下CTCs（陰性分選法）。陽性分選法是通過標記CTCs表面抗原直接捕獲CTCs，最常用于陽性分選法的抗原為EpCAM，其是CTCs特有的標志抗原，在CTCs中特異性高表達，而在血細胞中不表達。而陰性分選法則通過CTCs不表達的抗原（如CD45）來去除外周血細胞，以達到富集CTCs的目的［30］。下面將介紹幾種具體的CTCs分離富集方法。

2.1.1 免疫磁珠分離技術(shù) 免疫磁珠分離技術(shù)是一種以特異性抗原抗體反應為基礎的免疫學分離技術(shù)，利用細胞表面的特異性抗原與磁珠上的特異性單克隆抗體相結(jié)合，形成抗原-抗體-磁珠復合物，使細胞具有磁性，在磁場中被吸附并滯留于磁場中，相反無該種特異性抗原的細胞則不能與磁珠結(jié)合且不具有磁性，不能在磁場中逗留［31］。利用免疫磁珠分離技術(shù)分離CTCs，根據(jù)磁珠表面特異性抗體的不同分為陽性分選法和陰性分選法。陽性分選法主要利用磁珠表面抗EpCAM抗體與CTCs表面表達的特異性EpCAM相結(jié)合，從而捕獲到外周血液中的CTCs，目前在臨床上使用這種方法的代表是CellSearch系統(tǒng)，是目前唯一被美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準用于結(jié)直腸癌［5］、前列腺癌［32］和轉(zhuǎn)移性乳腺癌［33］CTCs檢測的免疫磁珠分離技術(shù)。但是，這種方法的不足在于其對CTCs的捕獲依賴于細胞表面EpCAM的表達，比較適用于EpCAM表達較高的腫瘤類型。部分CTCs由于發(fā)生了EMT而存在異質(zhì)性，不同類型CTCs表面的EpCAM表達不同，因此其在CellSearch系統(tǒng)中的檢出率可能偏低［34］。陰性分選法則是利用在CTCs中不表達，而外周血細胞中表達的相關(guān)抗原（通常是CD45）與磁珠上的特異性抗體結(jié)合，從而分離出外周血細胞，富集得到血液中的CTCs。陰性分選法不依賴于CTCs表面抗原的表達，不受EMT的影響，適合富集的CTCs類型相對陽性分選法較廣，同時其也可以避免磁珠直接作用于CTCs破壞細胞。但是陰性分選法步驟復雜，在操作過程中可能也會破壞 CTCs［31］。

2.1.2 基于微流體平臺的CTCs分離技術(shù)（CTCs-芯片）CTCs-芯片是一種具有抗EpCAM抗體涂層的微流體裝置，由精細構(gòu)造的微柱組成，允許分子較小的細胞自由通過，而將分子較大的細胞轉(zhuǎn)移到捕獲“陷阱”［35］。CTCs-芯片是近年逐漸發(fā)展起來的CTCs分離富集技術(shù)，其作用原理是將可結(jié)合CTCs的抗體固定在固相表面，當血液中的CTCs流經(jīng)芯片時即可被抗體特異性識別并選擇、富集。CTCs-芯片的優(yōu)勢在于可使用包被在不同固相表面的不同抗體，即聯(lián)合多種抗體捕獲CTCs，并且可以依照分子表型對不同類型的CTCs進行分別捕獲，有利于對不同類型的CTCs做進一步研究。目前，CTCs-芯片已在各類腫瘤研究中廣泛應用。NAGRATH等［35］發(fā)現(xiàn)CTCs-芯片對乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺癌以及肺癌患者的CTCs檢出率較高。SEQUIST等［36］研究發(fā)現(xiàn)利用CTCs-芯片富集得到的非小細胞肺癌CTCs，還可用于檢測其表皮生長因子的突變情況，以指導臨床個體化用藥。

2.1.3 體內(nèi)富集技術(shù) 目前研究人員已開發(fā)了從體內(nèi)分離CTCs的新方法，以便檢測更大流量的血液，即將結(jié)合EpCAM抗體的針形裝置自前臂靜脈插入并保持30 min，以在體內(nèi)進行CTCs的分離富集［37］。例如：CellCollector技術(shù)，由一種直徑0.5 mm的不銹鋼絲組成，帶有抗EpCAM抗體涂層，類似于靜脈導管，需要從靜脈插入，在血液循環(huán)中捕獲CTCs，此方法的優(yōu)勢在于不局限于血液的量，可獲取足夠的血液以獲取CTCs，目前已在肺癌、前列腺癌治療中應用，其安全性及有效性亦得到了初步驗證［38-39］。雖然這種方法值得嘗試，但還需要進行更多的臨床研究以確定CellCollector技術(shù)是否真正優(yōu)于傳統(tǒng)體外檢測裝置。

2.2 CTCs的鑒定 無論使用哪一種方法對CTCs進行富集，始終不能得到完全純化的CTCs。因此，必須鑒定所捕獲的細胞是否是CTCs。完成這一目標通常的方法是使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）對所捕獲的細胞進行染色，DAPI可與雙鏈DNA結(jié)合，證明捕獲的細胞具有細胞核，接著再使用不同標記的CKs抗體和白細胞抗原抗體（例如抗CD45抗體）來對這些具有細胞核的細胞進行分析［40］。富集的CTCs需要進行細胞計數(shù)以及分子分型，用于細胞計數(shù)的方法主要包括免疫細胞化學技術(shù)（如：免疫熒光法及熒光原位雜交法等）和流式細胞術(shù)等，用于分子分型的方法主要包括聚合酶鏈反應（PCR）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術(shù)等［41］。也有一些鑒定系統(tǒng)跳過富集步驟，使用簡化的方式來識別CTCs，例如：由EPIC Sciences開發(fā)的系統(tǒng)，將血液中的成核組分涂抹到帶有可黏附細胞的特殊涂層的載玻片上，隨后用DAPI和熒光標記的抗CKs抗體和抗CD45抗體染色載玻片，再用熒光掃描儀掃描，得到反映細胞形態(tài)學以及CKs和CD45表達情況的計算機圖像［42］。另一種以推定方式鑒定CTCs的方法是通過RT-PCR尋找上皮細胞標志物或相關(guān)抗原的轉(zhuǎn)錄物。有研究報道，在乳腺癌患者中，存在著CK-19 mRNA陽性的CTCs，因此可認為若使用RT-PCR技術(shù)檢測到了CK-19的mRNA，則可假設存在CTCs［43-45］。這種方法靈敏度高，但是這些轉(zhuǎn)錄子的存在也不能百分之百代表存在CTCs，需要對細胞進行進一步的表型分析或基因分型，這一方法很難實現(xiàn)。針對這一問題，研究人員發(fā)明了新的技術(shù)，即the Adna Test，通過此技術(shù)對感興趣的CTCs基因產(chǎn)物做進一步基因組標志物分析以補充檢測的完整性［46］。

3 CTCs在鼻咽癌中的應用

鼻咽癌是一種頭頸部惡性腫瘤，是常發(fā)于東南亞尤其是華南地區(qū)的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病與地理分布、環(huán)境和遺傳因素密切相關(guān)，EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）感染、吸煙史、高危飲食習慣等均可能是鼻咽癌的高發(fā)因素［47-49］，但具體病因尚未明確。鼻咽癌是一種放射敏感性腫瘤，其治療主要以放療和/或化療為主，隨著放療技術(shù)的提高，患者的5年生存率也在不斷提高，治療失敗的主要原因是原位復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，且疾病發(fā)展不易監(jiān)測［50-51］。但近年來，CTCs的研究為鼻咽癌的診斷、治療及預后評估提供了新方法。

ZHANG等［52］進行的一項納入50例鼻咽癌患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，46例患者被檢測出CTCs，陽性率為92.0%，且疾病分期與CTCs檢出率無明顯相關(guān)性。無論是無遠處轉(zhuǎn)移的初診患者（M0），還是復發(fā)或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者，CTCs數(shù)量均隨著TNM分期［53］增加而不斷增加（從Ⅱ期到Ⅳ期）。LI等［54］回顧性分析了38例鼻咽癌低分化鱗狀細胞癌患者，其中TNM Ⅰ期2例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例和Ⅳ期16例，分析患者放療前、放療后1周及放療后1個月外周血CTCs計數(shù)發(fā)現(xiàn)，52.6%的患者外周血中可以檢測到CTCs，放療后1個月CTCs明顯減少，結(jié)果表明CTCs數(shù)量和檢出率與TNM分期及其他臨床指標無相關(guān)性。HE等［55］在一項納入33例鼻咽癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，不同TNM分期患者均可檢測出CTCs，但檢出率與TNM分期無相關(guān)性。伍勇等［56］對63例初治鼻咽癌患者和20例正常對照人群的CTCs表達情況進行分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者CTCs陽性率為55.6%，正常人群不表達CTCs，并且發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者CTCs陽性與患者M分期（遠處轉(zhuǎn)移情況）相關(guān)，與T分期（腫瘤原發(fā)灶大?。?、N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）及總分期無關(guān)。吳君心等［57］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者外周血中CTCs陽性與患者N分期相關(guān)，CTCs陽性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更廣泛，提示預后不良，可能成為鼻咽癌患者預后評估的一個輔助指標。SI等［58］研究證實基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）存在于CTCs中，并在間質(zhì)細胞表型CTCs中表達最多。MMP-9是一種鋅依賴性內(nèi)肽酶，在降解環(huán)境屏障中發(fā)揮重要作用，在體內(nèi)外均可發(fā)揮促進轉(zhuǎn)移的作用［59-60］。除了轉(zhuǎn)移作用，MMP-9還被證明與鼻咽癌EBV感染密切相關(guān)［61］。LIU等［62］研究表明，MMP-9與鼻咽癌預后不良相關(guān)。

血漿EBV-DNA定量作為一項無創(chuàng)性檢測手段，是鼻咽癌診治的重要輔助手段，許多研究已將其用于鼻咽癌的診斷、危險分層、監(jiān)測和預后預測，同時CTCs也逐漸被作為一項有前景的鼻咽癌生物標志物來研究，因此，血漿EBV-DNA與CTCs是否具有協(xié)同作用，也成為鼻咽癌CTCs研究的一大熱點。HE等［55］的研究發(fā)現(xiàn)CTCs的存在可能與EBV的激活狀態(tài)有關(guān)，CTCs陽性鼻咽癌患者的EB病毒殼抗原相應IgA抗體（EBV VCA-IgA）水平高于CTCs陰性患者，且CTCs計數(shù)與EBV VCA-IgA和EBV-DNA載量相關(guān)，表明CTCs與鼻咽癌患者EBV活化呈正相關(guān)。伍勇等［56］研究也發(fā)現(xiàn)在EBV-DNA陰性鼻咽癌患者中，CTCs陽性率為45.5%，而在EBV-DNA陽性患者中，CTCs陽性率為78.9%，表明CTCs和EBV-DNA密切相關(guān)，CTCs聯(lián)合EBV-DNA水平用于鼻咽癌病情的評價。YOU等［63］在一項納入270例鼻咽癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，CTCs與血漿EBV-DNA水平相比，診斷鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移的靈敏度較差，但特異度較好，但兩者協(xié)同診斷靈敏度及特異度優(yōu)于單獨使用CTCs或EBV-DVA。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)在基線以及接受一線化療后這兩個時間點，CTCs計數(shù)與EBVDNA水平相對良好的患者，其無進展生存期和總生存期相對于有不良改變的患者均明顯延長，表明CTCs和血漿EBVDNA水平在一線化療前后和化療期間均可作為鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移患者的重要預后指標。且與影像學檢查結(jié)合，CTCs和EB-DNA則可以提供更加完善的預后信息。

4 前景與展望

隨著CTCs富集與鑒定技術(shù)的不斷進步，CTCs的臨床價值越來越凸顯，在鼻咽癌中的研究進展也在不斷更新。但是，要將CTCs檢測廣泛應用于鼻咽癌臨床實踐中，這條路還任重道遠。首先，大量研究中CTCs檢測技術(shù)的原理和方法不同，且各研究方法缺乏統(tǒng)一的標準，從而導致判斷標準及檢測結(jié)果存在較大差異，缺乏可比性，CTCs檢測技術(shù)有待進一步規(guī)范化和標準化；其次，在鼻咽癌患者中常規(guī)進行CTCs檢測并不常見，到目前為止發(fā)表的研究結(jié)果都是在小樣本群體進行研究的，CTCs在鼻咽癌中的研究結(jié)果缺乏前瞻性多中心大樣本研究。不同個體CTCs分子表型存在差異，且同一個體CTCs也具有異質(zhì)性，也是未來研究的重點、難點。期待在不久的將來CTCs檢測可為廣大鼻咽癌及各類腫瘤患者帶來更大的益處。

本文文獻檢索策略：

以“循環(huán)腫瘤細胞、特性、檢測方法、鼻咽癌”為關(guān)鍵詞檢索中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺， 以“circulating tumor cells、characteristics、detection、nasopharyngeal carcinoma” 為關(guān)鍵詞檢索 PubMed、Web of Science。檢索日期截至2019年9月，共檢索到200余篇文獻。文獻納入標準為描述循環(huán)腫瘤細胞特性、檢測方法及其在鼻咽癌中應用的文獻，排除循環(huán)腫瘤細胞單純應用于其他腫瘤治療的相關(guān)文獻，最終納入63篇文獻。

作者貢獻：曾蕾進行文章的構(gòu)思與設計，文獻/資料收集與整理，論文的撰寫與修訂；楊凱旋進行文章的可行性分析，負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。