食品中生物胺檢測方法的研究進(jìn)展

◎ 楊姍姍，于 毓，林翠蘋

（青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266073）

生物胺是一類含有氨基堿性有機(jī)化合物的總稱，主要是由微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧生成，廣泛存在于各類富含蛋白質(zhì)的食品中，如魚類、肉類、乳制品以及酒類等。生物細(xì)胞內(nèi)含有一定量的生物胺，對于維持機(jī)體正常生理功能具有重要意義，生物胺與蛋白質(zhì)、核酸和激素的合成有關(guān)，可以促進(jìn)生長、增強(qiáng)代謝、控制血壓、消除自由基、增強(qiáng)免疫力等。但是如果攝入量過多，會對人體造成一定傷害，出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、腦出血等不良反應(yīng)，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致死亡[1]，同時生物胺可與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌性物質(zhì)亞硝胺，威脅消費(fèi)者健康，因此需要對食品中生物胺含量進(jìn)行限制。組胺是生物胺中毒性最大的物質(zhì)。目前，我國在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動物性水產(chǎn)品》（GB 2733—2015）中僅規(guī)定高組胺魚類中生物胺含量不得高于 40 mg·kg-1，其他海水魚類不得高于 20 mg·kg-1。對其他食品中組胺以及總生物胺含量未作出規(guī)定。有學(xué)者曾提出將生物胺含量作為食品腐敗變質(zhì)的指標(biāo)。因此，需要對食品中生物胺含量進(jìn)行準(zhǔn)確、有效、方便、快速測定。本文主要總結(jié)了近年來食品中生物胺檢測方法的研究進(jìn)展，以期為提高食品中生物胺檢測方法效率和準(zhǔn)確性提供參考，為控制食品中生物胺含量提供技術(shù)支撐。

1 色譜方法

色譜方法是分析測定有機(jī)化合物最常用的檢測手段。世界上80%以上的化合物可通過色譜方法進(jìn)行測定。多數(shù)生物胺除組胺之外無發(fā)光基團(tuán)和熒光活性，需要對其進(jìn)行衍生化處理，才能在色譜儀上進(jìn)行檢測。常用的生物胺衍生試劑主要是丹磺酰氯、苯甲酰氯、鄰苯二醛等。根據(jù)衍生方式的不同，可以將衍生方法分為柱前衍生和柱后衍生。丹磺酰氯和苯甲酰氯常用作柱前衍生，鄰苯二醛常用作柱后衍生。

1.1 薄層色譜

薄層色譜是快速分離、鑒定和定量分析少量物質(zhì)常用的層析分離技術(shù)，其操作方便快捷、設(shè)備簡單、分析速度快，適用于小分子物質(zhì)分離。李燕君[2]通過優(yōu)化丹磺酰氯衍生方法，建立了薄層色譜半定量檢測黃酒中生物胺含量的方法，檢測限為0.125 ～ 5 μg·mL-1，定量限為 5 ～ 20 μg·mL-1，回收率為88.4%～114.8%，并將其應(yīng)用于半定量測定不同發(fā)酵階段黃酒生物胺含量。YU等[3]利用甲醇進(jìn)行萃取，基于重氮化對硝基苯胺與咪唑環(huán)的顯色反應(yīng)，建立薄層色譜圖像分析技術(shù)快速定量分析魚中組胺含量的方法，可以在45 min內(nèi)同時檢測多個樣品。GOMAA等[4]利用丹磺酰氯衍生，采用薄層色譜定量檢測埃及鯖魚中生物胺含量。

薄層色譜技術(shù)操作簡單快捷、成本低，不需要大型儀器，但是其準(zhǔn)確性和重復(fù)性有待提高。

1.2 液相色譜

液相色譜采用液體為流動相，固定相吸附目標(biāo)物質(zhì)，用流動相進(jìn)行沖洗，根據(jù)固定相與目標(biāo)物吸附性能的不同，分離目標(biāo)物進(jìn)行分析，其特點(diǎn)是分析準(zhǔn)確度高、分辨率高、靈敏度高、色譜柱可以反復(fù)利用，流出組分容易收集，可以分離多種有機(jī)化合物，所以廣泛應(yīng)用于生物分析、食品分析、環(huán)境分析、無機(jī)分析等多個領(lǐng)域。液相色譜最常用的檢測器有紫外-可見分光檢測器、發(fā)光二極管檢測器以及熒光檢測器等。曾雪晴等[5]采用丹磺酰氯對生物胺進(jìn)行柱前衍生，用紫外-可見分光檢測器分析測定郫縣豆瓣醬中生物胺（色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺）含量，8種生物胺線性范圍在0.5～50 mg·L-1，檢測限為 0.009 ～ 0.136 mg·L-1，回收率為76.33%～100.89%，結(jié)果表明21種郫縣豆瓣醬中生物胺總量未超過900 mg·kg-1，個別豆瓣醬中組胺和酪胺含量超過100 mg·kg-1，總胺含量超過 500 mg·kg-1。劉薇等[6]采用中空纖維液相微萃取技術(shù)，利用熒光檢測器測定水中腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺和精胺含量，5種生物胺線性范圍為0.10～100 mg·L-1，檢測限在0.01～0.03 mg·L-1，平均回收率為81.18%～85.63%。郭雯等[7]以領(lǐng)苯二甲醛為柱后衍生試劑，采用熒光檢測器測定干酪中6種生物胺含量，檢出限在0.30～0.76 μg·L-1，平均回收率為89.25%～103.09%。

質(zhì)譜與高效液相色譜聯(lián)用是常見的儀器聯(lián)用使用方法，綜合了高效液相色譜分離能力和質(zhì)譜良好的定性能力。FU等[8]以5-磺基水楊酸為萃取劑，采用苯甲酰氯柱前衍生，利用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行測定，檢測限范圍為0.1～10 mg·L-1，將其用于測定不同魚類中生物胺含量。沙麗娜等[9]采用連續(xù)三相液液萃取進(jìn)行前處理，未經(jīng)衍生，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定醬油中8種生物胺，檢測方法分析時間縮短至10 min，檢出限為0.3～1 mg·L-1。李麗萍等[10]采用改進(jìn)后的QuEChERS混合填料凈化紅酒樣品，不經(jīng)衍生，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定紅酒匯總分析組胺、酪胺、色胺和苯乙胺4種目標(biāo)物，4種生物胺檢出限為1.0 μg·L-1，定量限為3.0 μg·L-1，回收率在 94.7% ～ 106.7%。

液相色譜技術(shù)成熟、穩(wěn)定、可靠性高，與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用后，靈敏度更高、重現(xiàn)性好、線性范圍寬；但分離效率低、分析速度慢、操作復(fù)雜、成本高。整體而言，高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用是有效分離測定目標(biāo)物的方法。

1.3 離子色譜

離子色譜主要是通過目標(biāo)物與固定相離子官能團(tuán)之間的極性作用分離分析目標(biāo)物的一種液相色譜。朱作藝等[11]采用陽離子交換色譜分離，以甲基磺酸溶液為淋洗液，建立抑制型電導(dǎo)-紫外串聯(lián)檢測方法測定7種生物胺含量，方法檢出限在0.35～3.16 mg·kg-1，將其應(yīng)用于風(fēng)干牛肉、小黃魚以及帶魚樣品的測定，樣品加標(biāo)回收率為88.2%～108.8%。孫永等[12]通過優(yōu)化前處理方法，用抑制型電導(dǎo)檢測器快速測定水產(chǎn)品中生物胺含量，線性范圍為0.02～10.0 mg·kg-1，檢出限低于0.5 mg·kg-1，加標(biāo)回收率為85.2%～106.9%。丁海燕等[13]優(yōu)化生物胺提取劑，并對比不同蛋白沉淀方式，最終采用0.1 mol·L-1甲基磺酸提取，甲醇沉淀蛋白進(jìn)行前處理，電導(dǎo)檢測器和抑制器進(jìn)行檢測，檢出限低于1.60 mg·kg-1，樣品回收率在83.3%～101.8%。

離子色譜具有靈敏度高、選擇性好、樣品用量少、樣品前處理簡單、不需要衍生以及減少衍生化帶來的干擾和不穩(wěn)定性等特點(diǎn)，但樣品水中的陽離子會對檢測結(jié)果造成一定的影響。

1.4 氣相色譜

氣相色譜采用氣體作為流動相，目標(biāo)物氣化后被帶入色譜柱，根據(jù)樣品中目標(biāo)物的沸點(diǎn)、極性或者是吸附性能的不同，分離目標(biāo)物。其特點(diǎn)是分析速度快、分離效率高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣，但是要求目標(biāo)物能被氣化。ALMEIDA等[14]采用新型分散液-液液微萃取，即對胺同時進(jìn)行萃取和衍生，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定啤酒樣品中生物胺含量，方法檢出限為0.3～2.9 μg·L-1，樣品回收率為72%～113%。ABDURRAHMAN等[15]建立了氣相色譜-火焰離子檢測器對魚類中5種生物胺的檢測方法，方法檢出限為1.20～2.90 mg·L-1，生物胺回收率為98.41%～116.39%。王芳等[16]采用三氯乙酸提取，用強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱凈化，氮磷檢測器進(jìn)行檢測，建立了固相萃取-氣相色譜法測定腌肉中5種生物胺含量的方法，檢出限為0.12～0.32 mg·kg-1，樣品回收率為78%～96.8%。

氣相色譜方法不需要衍生處理，簡化了樣品處理程序，提高了效率。但部分生物胺不耐受高溫，容易發(fā)生分解，影響檢測的準(zhǔn)確率。

1.5 電泳技術(shù)

電泳技術(shù)利用帶電粒子在電場中移動速度不同達(dá)到分離目的。毛細(xì)管電泳采用高壓電場驅(qū)動，毛細(xì)管為分離通道，通過樣品中各組分之間淌度和分配行為差異實(shí)現(xiàn)液相分離，結(jié)合了電泳和色譜的分離技術(shù)。王冠等[17]利用18-冠-6-四羧酸與帶伯胺基團(tuán)的生物胺形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物可以與Na+發(fā)生取代反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對生物胺分子釋放-瞬時富集，建立了毛細(xì)管電泳安培在線富集檢測分析生物胺的方法，該方法檢出限為2.2～9.8 nmol·L-1，線性范圍為0.02～100 mol·L-1。張桂森等[18]構(gòu)建了毛細(xì)管電泳-連續(xù)光多子激發(fā)熒光檢測系統(tǒng)應(yīng)用于6種生物胺的測定，該方法使用熒光素異硫氰酸酯作為衍生試劑，方法檢出限為 0.055 ～ 0.085 μmol·L-1。劉方震[19]通過優(yōu)化檢測方法，建立了不需要衍生，即可采用固相萃取-毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用測定10種生物胺的方法，方法檢出限為 0.2 ～ 1.3 μmol·L-1。

電泳技術(shù)不需要衍生，不需要復(fù)雜的前處理過程，簡化了樣品前處理難度，分離效率高，分析速度快，檢出限低。

2 拉曼光譜方法

拉曼光譜基于拉曼散射效應(yīng)，是對與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析得到分子振動、轉(zhuǎn)動信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。拉曼光譜分析不需要特設(shè)的樣品制備步驟，具有無損檢測的優(yōu)勢，并且具有檢測速度快、高效、靈敏度高的特點(diǎn)。王楊[20]采用熒光胺對組胺進(jìn)行衍生化處理，建立高效薄層色譜-熒光光密度-表面增強(qiáng)拉曼光譜聯(lián)用快速檢測魚樣品中組胺含量的方法，方法檢測限為16.9 mg·kg-1，樣品回收率為80.0%～105.2%。

拉曼光譜檢測方法效率高，速度快，目標(biāo)物用量少，對樣品破壞小，對單一目標(biāo)物具有較好效果，但不能同時測定多種目標(biāo)物質(zhì)。

3 酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫技術(shù)主要是利用酶標(biāo)記的抗原（抗體）與樣品中的抗體（抗原）之間的相互作用，產(chǎn)生免疫復(fù)合物，保持酶活性，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物與樣品中的抗體（抗原）成比例，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性定量分析。孫叢叢[21]將酪胺與牛血清白蛋白、卵清蛋白偶聯(lián)，成功制備酪胺的免疫原與包被原，從新西蘭大耳白兔中得到特異性抗血清，通過層析法純化得到抗體，建立了間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，將其應(yīng)用豬肉、牛肉、魷魚和鱈魚中酪胺的檢測，樣品檢出限為1.2 mg·kg-1，樣品回收率為80.71%～101.12%。

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)快速、簡便、檢測限低，但對試劑選擇性高，且對結(jié)構(gòu)類似化合物具有交叉反應(yīng)，不能同時測定多種目標(biāo)物質(zhì)。

4 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)是利用分子印跡聚合物對印跡分子進(jìn)行專一識別的技術(shù)。田艷麗等[22]采用本體聚合法制備酪胺分子印跡聚合物，通過Scatchard模型評價了酪胺分子印跡聚合物的結(jié)合性，該聚合物對酪胺具有單一結(jié)合位點(diǎn)，最大吸附量 Qmax=248.33 μmol·g-1，平衡解離常數(shù) KD=1.76 μmol·g-1。孫世明等[23]采用表面分子印跡技術(shù)，通過溶膠凝膠方法在上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子表面合成對章魚胺有特異性識別位點(diǎn)的熒光分子印跡聚合物，該聚合物對章魚胺具有較好的特異性吸附和熒光響應(yīng)，從而建立一種定量檢測章魚胺的分子印跡熒光傳感方法，應(yīng)用于黃酒和乳酪中章魚胺的檢測，方法檢出限為0.37 mg·L-1，回收率為86%～98%。

分子印跡技術(shù)具有特異選擇吸附結(jié)合性能、容易制備聚合物、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，但其僅對特定的物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，不能同時檢測多種物質(zhì)，比較適用于快速篩查。

5 傳感器

傳感器主要是通過敏感元件感受被測量信息，轉(zhuǎn)換元件根據(jù)一定規(guī)律將測量信息轉(zhuǎn)換成電信號或其他形式的信息輸出，變換電路根據(jù)信號進(jìn)行放大，從而對特定物質(zhì)進(jìn)行選擇性分析。傳感器特點(diǎn)主要是微型化、數(shù)字化、智能化等。安東等[24]基于生物胺對三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]電化學(xué)發(fā)光信號具有增敏作用，以[Ru(bpy)32+]電化學(xué)發(fā)光信號為基礎(chǔ)，優(yōu)化毛細(xì)管電泳檢測條件，建立了毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用分離檢測水產(chǎn)品中組胺和亞精胺方法，組胺檢出限為0.496 μmol·L-1，亞精胺檢出限為 0.6 μmol·L-1。唐晗等[25]通過將二胺氧化酶固定化制作成酶柱，用作生物傳感器的識別元件，以魯米諾-鐵氰化鉀作為化學(xué)發(fā)光體系，檢測豬肉、鯽魚和葡萄酒中腐胺、組胺和酪胺含量，檢測限為 0.5 ～ 0.7 μmol·L-1，2 個月內(nèi)傳感器酶活僅降低15%。近年來，微/納米材料被用作生物分子載體，具有增強(qiáng)電化學(xué)信息、促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移、提高穩(wěn)定性等方面的優(yōu)勢。LEONARDO等[26]采用二胺氧化酶與磁珠進(jìn)行共軛，將其固定到鈷（Ⅱ）-酞菁/碳和普魯士藍(lán)/碳電極上獲得單酶生物傳感器，將其固定到HRP修飾的電極上得到雙酶生物傳感器，生物胺傳感器的檢測線性范圍為0.01～1 mmol·L-1。

制作傳感器用于生物胺的檢測，這種方法簡單、快速，可以用于生物胺的高通量分析，但是制作成的傳感器重現(xiàn)性一般，同時穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。

6 結(jié)語

生物胺廣泛存在于食品中，適量攝入生物胺對人體健康有益，但攝入量過多，會對人體造成傷害，需要對生物胺含量進(jìn)行準(zhǔn)確快速檢測，本文針對生物胺檢測方法展開論述，分別從色譜方法（薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜、離子色譜和電泳技術(shù)）、光譜方法、酶聯(lián)免疫檢測方法、分子印跡技術(shù)以及傳感器等方面進(jìn)行綜述。目前，針對生物胺的檢測方法發(fā)展很快，檢測速度、精度不斷提升，新型檢測手段層出不窮，但各類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。隨著技術(shù)手段不斷提高，檢驗(yàn)檢測能力的提升，未來開發(fā)高效、準(zhǔn)確、操作便捷、低成本、在線檢測方法越來越重要，這是食品檢測方法今后的發(fā)展方向。