崔垚鑫，劉俊華，周憶蓮，劉燕霏，楊建德

銅綠假單胞菌遺傳演化分析

崔垚鑫，劉俊華，周憶蓮，劉燕霏，楊建德通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

為研究銅綠假單胞菌（Pa）的遺傳演化規(guī)律，對(duì)2018年本實(shí)驗(yàn)室分離出兩株銅綠假單胞菌，經(jīng)基因測(cè)序得到16s rRNA基因序列，利用NCBI中的BLAST對(duì)比搜索與分離菌株具有相近基因序列的假單胞菌株，采用lasergene 中Megalign軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹并比較分析。結(jié)果表明：Pa菌株在基因進(jìn)化樹上聚為一支，說(shuō)明Pa進(jìn)化較穩(wěn)定，分離出的兩株P(guān)a與來(lái)自日本的Pa（登錄號(hào)為NR_113599）關(guān)系最為親近，他們聚在一個(gè)次級(jí)分支上；分離菌株與來(lái)自美國(guó)的兩株P(guān)a（登錄號(hào)為NR_117678與NR_114471）關(guān)系較親近，而與來(lái)自德國(guó)的Pa（登錄號(hào)為NR_026078）關(guān)系則較遠(yuǎn)。

銅綠假單胞菌；遺傳演化；基因樹；親緣關(guān)系

銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌，為革蘭陰性桿菌，該菌在1882年首先由Gersard氏從傷口膿液中分離到[1]。銅綠假單胞菌在環(huán)境中普遍存在，常見于正常人與動(dòng)物腸道、皮膚上，也可在外傷、燒傷及尿道感染等處發(fā)現(xiàn)。銅綠假單胞菌可感染多種動(dòng)物，造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失，常見的疾病如雛雞的急性敗血死亡、貂的出血性肺炎、羊的化膿性肺炎、竹鼠的急性死亡等[2-6]。近些年來(lái)，因?yàn)殂~綠假單胞菌感染人與動(dòng)物的報(bào)道與日俱增，逐漸引起了人們的注意。

16S rRNA基因長(zhǎng)度約為1 542 bp，序列長(zhǎng)度適中，其結(jié)構(gòu)中既有保守區(qū)又有變化區(qū)域，是較良好的生物標(biāo)識(shí)[7-8]?；驕y(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，特別是高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）的出現(xiàn)，在微生物鑒別方面起到了一定的作用[9-10]。本試驗(yàn)對(duì)從本實(shí)驗(yàn)室分離出的兩株銅綠假單胞菌的16S rRNA進(jìn)行同源序列比較并構(gòu)建基因進(jìn)化樹，探究其進(jìn)化規(guī)律，對(duì)大范圍內(nèi)防治此類細(xì)菌感染提供參考依據(jù)。

1 材料

本實(shí)驗(yàn)室分離出的兩株P(guān)a[11]。

2 方法

2.1 基因的測(cè)序與篩選

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離菌株P(guān)a-zhu和Pa-zr進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，其Genbank登錄號(hào)分別為MK713645和MK713646。利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST比對(duì)，將Pa的基因序列輸入到搜索框內(nèi)，用在線BLAST工具進(jìn)行比對(duì)，篩選基因一致性達(dá)到95%以上的多種假單胞菌。對(duì)這些序列進(jìn)行下載，查看序列信息并記錄。

2.2 基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用lasergene 中Megalign軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹并進(jìn)行同源性比較分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因的篩選

在NCBI中使用BLAST對(duì)比工具，將分離菌株的16S rRNA序列輸入搜索框內(nèi)，可得到100個(gè)相似的基因序列，從中挑選21個(gè)來(lái)源明確、長(zhǎng)度合適、同源性又達(dá)到95%以上的假單胞菌的 16S rRNA進(jìn)行下載，見表1。

表1 假單胞菌16S rRNA 基因序列信息

菌株名稱 國(guó)家 來(lái)源 登錄號(hào) 序列長(zhǎng)度/bp DSM 50071 Germany（德國(guó)） NCBI NR_026078.1 1 537 DSM 50071 USA（美國(guó)） NCBI NR_117678.1 1 527 ATCC 10145 USA（美國(guó)） NCBI NR_114471.1 1 489 NBRC 12689 Japan（日本） NCBI NR_113599.1 1 461 MCC10330 USA（美國(guó)） NCBI NR_043289.1 1 531 RA26 France（法國(guó)） NCBI NR_114957.1 1 379 ATCC 14235 USA（美國(guó)） NCBI NR_112062.1 1 507 ATCC 14909 USA（美國(guó)） NCBI NR_114472.1 1 459 NBRC 14159 Japan（日本） NCBI NR_113646.1 1 462 MI 33175 Korea（韓國(guó)） NCBI NR_117827.1 1 442 IPL-1 India（印度） NCBI NR_115922.1 1 438 Stanier 63 USA（美國(guó)） NCBI NR_037000.1 1 492 NBRC14167 Japan（日本） NCBI NR_113653.1 1 462 NBRC13583 Japan（日本） NCBI NR_113617.1 1 462 ATCC 8062 USA（美國(guó)） NCBI NR_114478.1 1 440 ATCC 25411 USA（美國(guó)） NCBI NR_114477.1 1 457 ATCC 17588 USA（美國(guó)） NCBI NR_041715.1 1 458 NBRC 14165 Japan（日本） NCBI NR_113652.1 1 462 ATCC 17588 China（中國(guó)） NCBI NR_103934.2 1 537 VKM B-075 Russia（俄羅斯） NCBI NR_116489.1 1 495 CCUG 11256 Spain（西班牙） NCBI NR_118798.1 1 456

3.2 基因序列同源性分析

采用lasergene 中Megalign軟件分析基因同源性可以看出，分離出的Pa-zhu與來(lái)自日本的Pa（登錄號(hào)為NR_113599）和來(lái)自美國(guó)的兩株P(guān)a（登錄號(hào)為NR_114471.1與NR_117678.1）的同源性達(dá)到99%以上；與來(lái)自法國(guó)的Pa（登錄號(hào)為NR_114957.1）的同源性則達(dá)到了98%以上，與其他菌株的基因序列相距較遠(yuǎn)。分離出的另一菌株P(guān)a-zr與來(lái)自美國(guó)的兩株P(guān)a（登錄號(hào)為NR_114471.1與NR_117678.1）的同源性達(dá)到99%以上；與來(lái)自日本的Pa（登錄號(hào)為NR_113599.1）和來(lái)自美國(guó)的Pa（登錄號(hào)為NR_043289.1）的同源性達(dá)到了98%以上，與其他菌株親緣性較遠(yuǎn)，見圖1。

圖1 基因同源性關(guān)系分析

3.3 基因序列進(jìn)化樹的構(gòu)建

將表1中的序列利用lasergene 中Megalign軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹并比較分析，見圖2?？梢钥闯?，Pa菌株在基因進(jìn)化樹上聚為一支，說(shuō)明Pa進(jìn)化較穩(wěn)定，分離出的兩株P(guān)a（登錄號(hào)為MK713645和MK713646）與來(lái)自日本的Pa（登錄號(hào)為NR_113599）的關(guān)系最為親近，他們聚在一個(gè)次級(jí)分支上，且同源關(guān)系在98.4 %～99.2 %之間，推測(cè)在中國(guó)分離出的兩株P(guān)a與來(lái)自日本的Pa（登錄號(hào)為NR_113599）是由共同的祖先在亞洲的不同國(guó)家間形成了交叉進(jìn)化；分離菌株與來(lái)自美國(guó)的兩株P(guān)a（登錄號(hào)為NR_117678與NR_114471）的關(guān)系較親近，同源關(guān)系在99.0 %～99.4 %之間；而與來(lái)自的德國(guó)的Pa（登錄號(hào)為NR_026078）關(guān)系則較遠(yuǎn)，同源關(guān)系在95.8 %～96.1 %之間。從本國(guó)分離出來(lái)的兩株P(guān)a在進(jìn)化樹上與其他假單胞菌的關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 銅綠假單胞菌遺傳進(jìn)化樹分析

4 討論

銅綠假單胞菌為人類醫(yī)學(xué)中的常見菌類，但在近些年，Pa給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的損失，銅綠假單胞菌可引起犢牛便血、雛雞內(nèi)臟出血和羊劇烈腹瀉，最終導(dǎo)致動(dòng)物死亡[12]。通過(guò)研究分離出的銅綠假單胞菌與其他假單胞菌的遺傳演化關(guān)系，可以為預(yù)防和治療銅綠假單胞菌造成的疾病提供一定的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，所有的銅綠假單胞菌全部匯聚在一個(gè)分支上，說(shuō)明銅綠假單胞菌在基因進(jìn)化中相對(duì)穩(wěn)定，且銅綠假單胞菌的進(jìn)化節(jié)點(diǎn)較靠前，說(shuō)明銅綠假單胞菌在假單胞菌中屬于較古老的品種。從我國(guó)分離出的菌株（登錄號(hào)為MK713645和MK713646）與日本的銅綠假單胞菌（登錄號(hào)為NR_113599）和美國(guó)的兩株銅綠假單胞菌（登錄號(hào)為NR_117678與NR_114471）源自同一祖先，這可能與這幾個(gè)國(guó)家經(jīng)貿(mào)或旅游往來(lái)密切有關(guān)，了解發(fā)達(dá)國(guó)家銅綠假單胞菌的研究可為我們防治此類感染提供重要的參考依據(jù)。銅綠假單胞菌與屬內(nèi)其他假單胞菌也存在一定的親緣關(guān)系，但遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。施氏假單胞菌（與產(chǎn)堿假單胞菌（）在基因進(jìn)化樹上分別各聚一支，二者在基因進(jìn)化樹上的支點(diǎn)相對(duì)靠后，說(shuō)明兩種菌株雖然品種較新，但在進(jìn)化過(guò)程中也趨向穩(wěn)定。而食油假單胞菌（與類產(chǎn)堿假單胞菌（）在基因樹上聚為一支，說(shuō)明兩株菌株在進(jìn)化趨勢(shì)上相對(duì)穩(wěn)定，兩者是由同一祖先進(jìn)化而來(lái)的[13-14]。

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Genetic Evolution Analysis of

CUI Yao-xin, LIU Jun-hua, ZHOU Yi-lian, LIU Yan-fei, YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to study the genetic evolution of（Pa）, two strains of Pa were isolated in our laboratory in 2018. The 16s rRNA gene sequence was obtained by gene sequencing. The BLAST in NCBI was used to search forstrains with similar gene sequence to the isolated strains, and Megalign software in lasergene was used to construct the gene evolutionary tree and make comparative analysis. The results showed that Pa strains clustered into one branch on the gene evolution tree, indicating that Pa evolution was relatively stable. The two isolated Pa strains had the closest relationship with Pa from Japan（login number is NR_113599）, and they clustered on a secondary branch. The relationship between the isolated strain and Pa（Genbank login numbers NR_117678 and NR_114471）from the United States is relatively close. However, the relationship with Pa from Germany（login number is NR_026078）was far away.

; genetic evolution; gene tree; genetic relationship

1008-5394（2020）02-0052-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.012

S852.61

A

2019-05-13

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201810061047）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（07JCYBJC16000）

崔垚鑫（1997-）男，本科在讀，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：1977008536@qq.com。

楊建德（1969-）男，教授，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方面的教學(xué)與研究。E-mail：jiandeyang@126.com。

責(zé)任編輯：張愛(ài)婷