謝海納，潘志強(qiáng)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

皮質(zhì)醇增多癥是腎上腺皮質(zhì)長(zhǎng)期分泌過量皮質(zhì)激素引起的綜合征，其中，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)非依賴性皮質(zhì)醇增多癥是由于腎上腺皮質(zhì)腫瘤或增生導(dǎo)致自主分泌過量皮質(zhì)醇。血液中高皮質(zhì)醇通過影響血糖、血脂、電解質(zhì)和其他激素的平衡，會(huì)導(dǎo)致滿月臉、向心性肥胖、高血壓、痤瘡、繼發(fā)性糖尿病、月經(jīng)失調(diào)、性功能障礙、骨質(zhì)疏松等臨床表現(xiàn)。

中醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇增多癥常伴隨陰虛內(nèi)熱證候發(fā)生，采用滋陰清熱中藥比如黃柏、知母、丹皮、生地黃、鱉甲等均有助于改善證候。其中，黃柏是代表性的中藥，其性苦、寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明[1-2]，黃柏含有小檗堿、黃柏堿、黃柏酮等多種活性成分，其中小檗堿具有抗菌、抗炎、解熱、降血糖、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等藥理活性，而對(duì)黃柏堿、黃柏酮的抗炎、抗腫瘤活性也有散在報(bào)道[3-5]。本研究在探索黃柏主要成分對(duì)腎上腺皮質(zhì)激素合成影響過程中，發(fā)現(xiàn)黃柏酮具有抑制Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮合成與分泌作用，茲報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃柏酮(分子式:C26H30O7，分子量:454.51，分子結(jié)構(gòu)見圖1)。

圖1 黃柏酮的分子結(jié)構(gòu)

米托坦(Sigma-Aldrich，貨號(hào)：SML1885);Cell Cycle Staining(聯(lián)科生物，貨號(hào)：A92380144)試劑盒；Mito-Tracker Green線粒體綠色熒光探針(上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：C1048)；Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)(上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：C1029)；乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司,貨號(hào)：C0017)。RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：P0013C)；RNAiso Plus(TaKaRa，貨號(hào)：9109)，PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa，貨號(hào)：RR036A)，SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)Ⅱ(TaKaRa，貨號(hào)：RR820A)；小鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒(Cayman，貨號(hào)：501320)，β-actin抗體(Sigma-Aldrich，貨號(hào)：A5441)；類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)抗體(Abcam，貨號(hào)：ab96637)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(CYP11A1)抗體(Abcam，貨號(hào)：ab175408)、11β-羥化酶1(CYP11B1)(Abcam，貨號(hào)：ab229884)、Mitofusin 1(Mfn1)(Abcam，貨號(hào)：ab129154)、Mitofusin 2(Mfn2)(Abcam，貨號(hào)：ab124773)。

胎牛血清(Corning，貨號(hào)：35-015-CV)、100 U/L青鏈霉素(Corning，貨號(hào)：30-002-CIa)、DMEM-F12培養(yǎng)液(Corning，貨號(hào)：10-092-CV)，胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma-Aldrich，貨號(hào)：T3924)。采用Primer3(v0.4.0)在線軟件設(shè)計(jì)引物并委托Life Technologies公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.2 儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，QuantStudio 3型)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司，Elx800型)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，5417R型)；小型垂直電泳槽(美國(guó)BIO-RAD公司)，轉(zhuǎn)膜儀(Mini-PROTEAN Tetra型)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Protein-Simple公司，Alpha型)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司，CytoFlex S型)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司，SP-8型)。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞活性的影響

Y1細(xì)胞種植于96孔板中，每孔細(xì)胞密度1×104，次日采用2.5～160 μmol/L黃柏酮干預(yù)24 h后，吸棄培養(yǎng)液并用PBS沖洗1次。加入5 g/L的MTT溶液(避光保存)繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上液加入150 μL的DMSO，在搖床上避光混勻15 min后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD570讀數(shù)值。每個(gè)濃度組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)。

2.2 黃柏酮對(duì)細(xì)胞毒性(LDH法)的影響

采用含10%血清生長(zhǎng)培養(yǎng)液，將Y1細(xì)胞種植于96孔板中，次日采用低血清培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為1%的血清)配藥，經(jīng)過40～160 μmol/L黃柏酮處理24 h后，依據(jù)LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒使用說明，采用Y1細(xì)胞培養(yǎng)上液，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞周期的影響

采用6孔板鋪板Y1細(xì)胞，以80 μmol/L黃柏酮處理24 h，50 μmol/L米托坦作為陽性對(duì)照，用0.25%胰酶-EDTA消化，PBS洗1次后采用Cell Cycle Staining試劑盒進(jìn)行PI單染，避光孵育30 min后在流式儀中檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.4 共聚焦顯微鏡檢測(cè)黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞線粒體膜的影響

采用共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿進(jìn)行鋪板，80 μmol/L黃柏酮與50 μmol/L米托坦干預(yù)24 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定5～10 min后，PBS洗2次，先用Mito-Tracker Green線粒體綠色熒光探針染色，再用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液染色，在激光共聚焦下拍攝細(xì)胞染色照片。

2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌液皮質(zhì)酮含量

Y1細(xì)胞在低血清培養(yǎng)液(血清體積分?jǐn)?shù)為1%)中，經(jīng)過80 μmol/L黃柏酮處理24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，依據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)未稀釋的原液中皮質(zhì)酮含量。

2.6 qPCR檢測(cè)黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮合成酶mRNA表達(dá)

采用6孔板鋪板Y1細(xì)胞，以40、80、160 μmol/L黃柏酮干預(yù)Y1細(xì)胞24 h，及80 μmol/L黃柏酮干預(yù)Y1細(xì)胞24、36、48 h。按照RNAiso Plus試劑盒說明書抽提細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μmol/L，反應(yīng)條件為37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，4 ℃；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃×3 min，95 ℃×5 s，60 ℃×30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析。

2.7 Western blot檢測(cè)黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮合成酶蛋白表達(dá)

采用6孔板鋪板Y1細(xì)胞，以80 μmol/L黃柏酮干預(yù)Y1細(xì)胞24 h，采用RIPA裂解液處理Y1細(xì)胞，收集蛋白質(zhì)樣品并予以定量，通過變性處理，分別執(zhí)行聚丙烯凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再洗滌、顯影等實(shí)驗(yàn)流程，其中，一抗?jié)舛葍?nèi)參β-actin以1∶20 000稀釋，抗體StAR、CYP11A1、CYP11B1均以1∶2 000稀釋；Mfn1以1∶10 000稀釋；Mfn2以1∶5 000稀釋。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞活性的影響

采用2.5～160 μmol/L黃柏酮干預(yù)Y1細(xì)胞24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞OD570讀數(shù)值。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，2.5～40 μmol/L黃柏酮對(duì)細(xì)胞的抑制率約為35%(P<0.01)，160 μmol/L黃柏酮對(duì)細(xì)胞抑制率達(dá)60%以上(P<0.01)。提示黃柏酮可以顯著抑制Y1細(xì)胞活性。進(jìn)而檢測(cè)黃柏酮對(duì)細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果顯示，80 μmol/L以上黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞有10%～20%的毒性作用。見圖2。

注：與對(duì)照組比較，。

3.2 黃柏酮對(duì)細(xì)胞周期的影響

結(jié)果見圖3。與對(duì)照組比較，80 μmol/L黃柏酮與50 μmol/L米托坦均導(dǎo)致G1期細(xì)胞顯著增加(P<0.01)，表明黃柏酮具有阻滯Y1細(xì)胞周期于G1期的作用。

注：與對(duì)照組比較，。

3.3 黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞線粒體膜的影響

與對(duì)照組比較，米托坦處理后細(xì)胞線粒體增亮；黃柏酮處理后細(xì)胞線粒體更加明亮，提示黃柏酮可能通過影響線粒體膜擴(kuò)張導(dǎo)致線粒體膜更加豐富，從而影響線粒體膜類固醇激素合成酶功能及其皮質(zhì)酮合成過程，見圖4。進(jìn)而檢測(cè)了黃柏酮對(duì)線粒體膜蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黃柏酮顯著抑制Mfn1、Mfn2蛋白表達(dá)(P<0.01)，提示黃柏酮可影響線粒體功能，見圖5。

對(duì)照組 米托坦組 黃柏酮組

注：與對(duì)照組比較，。

3.4 黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮分泌的影響

與對(duì)照組比較，黃柏酮可降低皮質(zhì)酮含量，提示黃柏酮可能具有抑制Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮分泌的作用，見圖6。

注：與對(duì)照組比較，

3.5 不同濃度黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮合成酶基因表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用40～160 μmol/L黃柏酮干預(yù)Y1細(xì)胞24 h，檢測(cè)皮質(zhì)酮合成酶基因表達(dá)。與對(duì)照組比較，各濃度黃柏酮均顯著抑制Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd3b2、SF-1基因表達(dá)(P<0.05～0.01)，160 μmol/L黃柏酮顯著增強(qiáng)Star、Cyp21a1、Nr4a1、Nr4a2基因表達(dá)(P<0.01)，見圖7。由于Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1是皮質(zhì)酮合成的重要酶的基因，Nr4a1、Nr4a2、SF-1、Hsd3b2是調(diào)節(jié)各酶的重要轉(zhuǎn)錄因子，提示黃柏酮主要通過抑制皮質(zhì)酮合成酶基因表達(dá)，抑制皮質(zhì)酮合成過程。

注：與對(duì)照組比較，。

3.6 黃柏酮48 h對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮合成酶基因表達(dá)的影響

進(jìn)一步檢測(cè)黃柏酮延長(zhǎng)給藥至48 h后對(duì)Y1細(xì)胞類固醇激素合成酶基因表達(dá)的影響。與對(duì)照組比較，黃柏酮持續(xù)給藥48 h內(nèi)，均顯著抑制Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Hsd3b2基因表達(dá)(P<0.01)，然而促進(jìn)Star基因表達(dá)(P<0.01)，見圖8。

注：與對(duì)照組比較，。

3.7 黃柏酮對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)酮合成酶蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，黃柏酮與米托坦均顯著抑制CYP11A1和StAR蛋白表達(dá)(P<0.01)，見圖9，提示黃柏酮可能主要通過CYP11A1酶發(fā)揮抑制皮質(zhì)酮生成的作用。

注：與對(duì)照組比較，

4 討論

腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞是合成皮質(zhì)激素的主要場(chǎng)所(人類有活性的是皮質(zhì)醇，嚙齒動(dòng)物有活性的是皮質(zhì)酮)。皮質(zhì)激素合成以膽固醇為原料，經(jīng)線粒體外膜StAR接受膽固醇后快速轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜，在線粒體內(nèi)膜P450側(cè)鏈裂解酶(P450scc，由Cyp11a1基因編碼)作用下，膽固醇裂解為孕烯醇酮，再經(jīng)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)連接膜(Mitochondria-ER associated membranes,MAMs)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)酶3β-HSD、CYP21A作用下合成各種類固醇激素的中間產(chǎn)物，最后類固醇激素中間產(chǎn)物經(jīng)MAMs返回穿梭至線粒體內(nèi)，在CYP11B1作用下合成皮質(zhì)酮。因此，皮質(zhì)酮合成量主要受線粒體膜上重要酶的影響，腎上腺皮質(zhì)癌一線治療的靶向藥物米托坦的藥理作用機(jī)制正是通過作用于線粒體抑制了類固醇激素合成酶的活性，從而阻止了皮質(zhì)細(xì)胞激素的合成過程。

臨床皮質(zhì)醇增多癥所致的陰虛內(nèi)熱常使用黃柏，因此，本研究選擇黃柏所含成分黃柏酮進(jìn)行了研究。黃柏酮主要來源于蕓香科柑橘屬、能清熱解毒燥濕的黃柏、白鮮皮等，研究發(fā)現(xiàn)黃柏酮具有抗炎[6-7]、防治肺損傷和肺纖維化[8]等作用。此外，黃柏酮在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[9-12]，也可通過下調(diào)Akt磷酸化水平來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，減輕內(nèi)膜增生，抑制靜脈橋再狹窄的發(fā)生[13]。本研究發(fā)現(xiàn)黃柏酮具有顯著抑制Y1小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞活性，且黃柏酮與米托坦一樣，均顯著阻滯細(xì)胞于G1期，提示黃柏酮可以通過阻滯細(xì)胞周期以抑制細(xì)胞增殖。

值得注意的是，本研究重點(diǎn)探索了黃柏酮對(duì)線粒體膜的影響，通過共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)黃柏酮可以導(dǎo)致Y1細(xì)胞線粒體膜亮度增強(qiáng)，進(jìn)一步檢測(cè)了線粒體膜上重要的標(biāo)志性蛋白Mfn1與Mfn2，以及合成皮質(zhì)酮的線粒體膜類固醇激素合成酶，發(fā)現(xiàn)黃柏酮可抑制Cyp11b1基因表達(dá)，提示黃柏酮可以通過影響線粒體膜結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能分子，從而抑制皮質(zhì)酮合成與分泌。此外，黃柏酮還顯著抑制了定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脫氫酶HSD3B2與胞漿中的轉(zhuǎn)錄因子SF-1，SF-1參與類固醇激素合成酶CYP11A1、CYP11B1、HSD3B2的調(diào)控作用，且隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，上述基因被抑制得更加顯著，提示黃柏酮可能靶向作用于類固醇激素合成酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，從而抑制了皮質(zhì)酮合成過程。然而，160 μmol/L黃柏酮卻顯著增強(qiáng)孤兒核受體Nr4a1、Nr4a2基因表達(dá)，也促進(jìn)Star與Cyp21a1基因表達(dá)，其中，Star、Nr4a1、Nr4a2屬于即刻早期基因，Cyp21a1可轉(zhuǎn)錄定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的皮質(zhì)酮前體物質(zhì)合成酶，提示黃柏酮處理Y1細(xì)胞后，可能導(dǎo)致細(xì)胞代償性反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了黃柏酮可抑制腎上腺皮質(zhì)激素合成與分泌，臨床使用黃柏治療具有陰虛內(nèi)熱證的皮質(zhì)醇增多癥患者，黃柏酮是其藥效發(fā)揮的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。