扇貝來(lái)源碳量子點(diǎn)性質(zhì)及其與鎘的聯(lián)合毒性

王慶紅，譚明乾，齊子和，王海濤,

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

納米材料具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、高反應(yīng)活性和量子效應(yīng)[1-3]，對(duì)人類(lèi)身體健康有著潛在的風(fēng)險(xiǎn)。隨著納米技術(shù)在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們?cè)絹?lái)越重視其可能導(dǎo)致的負(fù)面健康效應(yīng)。目前研究主要集中在外源添加的納米粒子上[4-5]；除外源添加的納米粒子外，食品在加工過(guò)程中也可產(chǎn)生具有納米結(jié)構(gòu)的顆粒[6-8]，然而這一類(lèi)食源性納米粒子的性質(zhì)還缺乏研究。

碳量子點(diǎn)（carbon quantum dots，CQDs）是一類(lèi)新型納米結(jié)構(gòu)，以碳、氧、氫為主要組分，直徑一般小于10 nm，最先在純化碳納米管過(guò)程中發(fā)現(xiàn)[9]。Sk等[10]在焦糖中分離得到碳納米粒子，首次將CQDs與食品聯(lián)系起來(lái)。近期研究發(fā)現(xiàn)，CQDs在食品中分布廣泛；如Jiang Chengkun等[11]在雀巢咖啡中發(fā)現(xiàn)了CQDs；Song Xunyu等[12]報(bào)道了烤雞胸肉中的CQDs。食品中CQDs的形成與加工方式密切相關(guān)。熱加工是食品工業(yè)中常用的加工方式，高溫下食品組分發(fā)生復(fù)雜的相互作用，這些反應(yīng)能夠?qū)е录{米顆粒的形成。納米材料相對(duì)比表面積較大，且表面自由能較高，能夠和其他分子通過(guò)氫鍵等發(fā)生相互作用。如烤魚(yú)中分離得到的CQDs能夠通過(guò)氫鍵與胃蛋白酶發(fā)生相互作用[13]。除蛋白質(zhì)外，食源性CQDs還能與金屬離子發(fā)生相互作用，如烤制牛肉中獲取的CQDs可以通過(guò)與鐵離子相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵元素的載運(yùn)[14]；牛肉湯中獲取的CQDs能夠和鋅離子相互作用[15]。

鎘是一種重金屬元素，具有明顯毒性，長(zhǎng)期接觸鎘對(duì)人體健康有害[16]。鎘可以通過(guò)食物鏈傳遞，在器官中積累[17]。研究表明，鎘離子（Cd2+）對(duì)哺乳動(dòng)物的器官，包括肺、腎、睪丸以及心血管、造血系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)都會(huì)造成損害[18]。魚(yú)類(lèi)和軟體動(dòng)物等水生生物對(duì)鎘具有極強(qiáng)的富集能力，可沿食物鏈轉(zhuǎn)移蓄積，具有隱藏性和不可逆性等特點(diǎn)[19]，是影響水產(chǎn)品食用安全的重要因素之一。貝類(lèi)具有很強(qiáng)的富集重金屬的能力[20]，在貝類(lèi)加工過(guò)程中，特別是在熱加工過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生CQDs，這種納米結(jié)構(gòu)與貝類(lèi)中的Cd2+發(fā)生相互作用，可能會(huì)影響鎘本身的毒性。本實(shí)驗(yàn)采用蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）作為研究對(duì)象，通過(guò)透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀(guān)察、X射線(xiàn)光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析等系統(tǒng)表征來(lái)源于蝦夷扇貝的CQDs，并采用等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）法考察CQDs與Cd2+的相互作用，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CQDs對(duì)Cd2+毒性的影響，以期為深入認(rèn)識(shí)食源性納米顆粒的性質(zhì)及其潛在的健康影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦夷扇貝購(gòu)于大連市甘井子區(qū)仟和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（pheochromocytoma，PC12）細(xì)胞獲取自中國(guó)科學(xué)院上海科學(xué)院細(xì)胞資源中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)。

乙酸乙酯天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；溴化鉀北京百靈威科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基美國(guó)Gibco公司；胎牛血清北京四季青生物科技有限公司；青鏈霉素混合液（雙抗）美國(guó)Hycone公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）北京寶希迪科技有限公司；體積分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫大連博諾科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）測(cè)定試劑盒、線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda 35紫外-可見(jiàn)光譜儀、FTIR儀美國(guó)PerkinElmer有限公司；F-2700熒光分光光度計(jì)日立（中國(guó)）有限公司；JEM-2100（UHR）TEM日本電子株式會(huì)社；Escalab 250Xi XPS儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；NU-437-400s超凈工作臺(tái)、NU-5810E二氧化碳培養(yǎng)箱美國(guó)Nuaire公司；FACSVerse流式細(xì)胞儀美國(guó)BD公司；Infinite M200多功能酶標(biāo)儀、普通熒光酶標(biāo)儀瑞士Tecan公司；XRD-7000S X射線(xiàn)衍射（X-ray diffraction，XRD）儀日本島津公司；FLS-980穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司；Affinity ITC儀美國(guó)TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 CQDs的制備

取2 g蝦夷扇貝貝柱于反應(yīng)釜中，加入7 mL去離子水，180 ℃加熱4 h。4 000 r/min離心5 min，收集上清液。上清液采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取后置于3 500 Da的透析袋內(nèi)于常溫下透析。收集透析袋外溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，使用500 Da的透析袋在常溫下透析，收集透析袋內(nèi)溶液，冷凍干燥，得到CQDs，于-20 ℃冰箱凍存。

1.3.2 CQDs的表征

以2,5-二羥基苯甲酸為基質(zhì)，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）測(cè)定CQDs的分子質(zhì)量。將1 mg/mL CQDs水溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，滴至超薄碳膜網(wǎng)上，在室溫下干燥后使用TEM觀(guān)察CQDs形貌，加速電壓為200 kV。隨機(jī)選取TEM照片中100 個(gè)CQDs并測(cè)量其直徑，獲得CQDs的粒徑分布結(jié)果。采用XRD儀分析CQDs晶體結(jié)構(gòu)，分析條件：采用Cu靶，管壓30 kV、管流20 mA、掃描速率5（°）/min、衍射角度2θ范圍5°～80°。采用XPS儀分析CQDs的元素組成和表面基團(tuán)，分析條件：?jiǎn)紊玐射線(xiàn)源Al Kα作為激發(fā)源，激發(fā)電壓1 486.6 eV，結(jié)合能用污染碳C1s（結(jié)合能284.8 eV）進(jìn)行校準(zhǔn)。采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀對(duì)CQDs進(jìn)行掃描，分析條件：掃描范圍700～200 nm、掃描速率1 200 nm/min，去離子水作為空白對(duì)照。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定CQDs熒光光譜，分析條件：狹縫寬度10 nm。通過(guò)穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測(cè)定CQDs熒光壽命。采用壓片法測(cè)定CQDs FTIR光譜，溴化鉀為背景，掃描范圍500～4 000 cm-1。

1.3.3 CQDs與Cd2+相互作用分析

使用PBS分別配制成濃度4 mmol/L CQDs溶液和10 mmol/L Cd2+溶液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后置于真空脫氣機(jī)中進(jìn)行脫氣處理。將350 μL CQDs溶液注入ITC儀樣品池中，130 μL Cd2+溶液加入注射器中。溫度25 ℃、滴定速率180 s/滴、滴定間隔300 s、滴定40 滴、攪拌速率80 r/min。通過(guò)NanoAnalyze軟件Independent Binding模式分析擬合數(shù)據(jù)，確定CQDs和Cd2+間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)（結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）、焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變（ΔG））。

1.3.4 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

1.3.4.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性

將PC12細(xì)胞以104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中。使用完全培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，用含有不同質(zhì)量濃度（0.12～1.00 mg/mL）CQDs、10 μmol/L Cd2+或CQDs-Cd2+（CQDs質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL或0.12 mg/mL，Cd2+濃度為10 μmol/L）的新鮮完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。然后去除孔板中培養(yǎng)基，加入20 μL 5 mg/mL MTT孵育4 h。除去孔板中MTT溶液后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min，用多功能酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度與活細(xì)胞數(shù)成正比[21]。以不含CQDs、Cd2+或CQDs-Cd2+的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.3.4.2 ROS水平檢測(cè)

將PC12細(xì)胞接種于12 孔板中，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔板約85%后去除孔板中原有培養(yǎng)基，加入10 μmol/L Cd2+溶液以及終濃度10 μmol/L Cd2+與終質(zhì)量濃度0.06 mg/mL CQDs的混合溶液，繼續(xù)孵育24 h；使用過(guò)氧化氫處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組。處理20 min后收集細(xì)胞，離心去上清液，使用500 μL PBS重懸后避光加入10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽，在37 ℃下避光染色30 min，離心收集細(xì)胞，采用PBS重懸后轉(zhuǎn)移至黑色96 孔板中，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度[22]。ROS水平以處理組與對(duì)照組熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.3.4.3 線(xiàn)粒體膜電位測(cè)定

將PC12細(xì)胞接種于12 孔板中，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔板約85%后分別加入含有10 μmol/L Cd2+以及終濃度10 μmol/L Cd2+與終質(zhì)量濃度0.06 mg/mL CQDs混合溶液的培養(yǎng)基，使用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）作為陽(yáng)性對(duì)照組。處理20 min后收集細(xì)胞，離心去上清液，加入500 μL JC-1染劑，避光孵育20 min，離心后采用JC-1染色緩沖液重懸，繼續(xù)用JC-1染色緩沖液洗滌2 次，樣品轉(zhuǎn)移至96 孔板，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)JC-1單體（激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）和JC-1聚合物（激發(fā)波長(zhǎng)570 nm、發(fā)射波長(zhǎng)590 nm）熒光強(qiáng)度。以JC-1聚合物與其單體的熒光強(qiáng)度比值表示線(xiàn)粒體膜電位[22]。

1.3.4.4 細(xì)胞周期的檢測(cè)

將PC12細(xì)胞以每孔106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)基，分別加入含有10 μmol/L Cd2+以及終濃度10 μmol/L Cd2+與終質(zhì)量濃度0.06 mg/mL CQDs混合溶液的培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h，胰酶消化收集細(xì)胞，離心去上清液，用PBS再次清洗細(xì)胞后離心去上清液，加入1 mL冰浴預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，輕輕吹打均勻，4 ℃固定24 h。離心后棄去固定液，加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，棄去PBS，加入0.5 mL染色緩沖液，10 μL 100 μg/mL RNase和25 μL 50 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI），37 ℃下避光孵育30 min，最后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著），使用Origin Pro 8.5軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝來(lái)源CQDs的表征結(jié)果

食源性CQDs普遍存在于日常生活所食食物中，這些CQDs是食品中某些組分，如蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)在高溫條件下相互作用形成的。已有報(bào)道表明，在烤制食品和飲料中發(fā)現(xiàn)了CQDs，因此推測(cè)蝦夷扇貝在熱加工過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生CQDs。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離心沉淀及透析，提取并純化了蝦夷扇貝熱加工過(guò)程中可能產(chǎn)生的CQDs。由圖1A可知，扇貝來(lái)源CQDs溶液在可見(jiàn)光照射下呈淺黃色，考察CQDs在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外-可見(jiàn)光吸收情況發(fā)現(xiàn)，在260 nm附近有1 個(gè)明顯的吸收峰，這可能由共軛分子的π→π*電子躍遷引起[23]。由圖1B可知，在紫外光照射下，扇貝來(lái)源CQDs溶液能夠發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm；熒光光譜分析結(jié)果表明，在300～390 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，扇貝來(lái)源CQDs最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)隨其激發(fā)波長(zhǎng)的增大而增大，同時(shí)熒光強(qiáng)度相應(yīng)減小，這種熒光紅移現(xiàn)象是CQDs的典型特征[24]。通過(guò)TEM觀(guān)察CQDs形態(tài)，如圖1C所示，蝦夷扇貝中CQDs形貌接近球形，分散性良好，沒(méi)有明顯聚集；同時(shí)在高分辨TEM圖像中觀(guān)察到CQDs晶格結(jié)構(gòu)，晶格間距為0.18 nm。TEM結(jié)果進(jìn)一步證明了CQDs的存在。粒徑分析結(jié)果如圖1D所示，蝦夷扇貝中CQDs粒徑分布相對(duì)較窄，主要集中在2～6 nm，平均粒徑為3.7 nm。

圖 1 扇貝來(lái)源CQDs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜與熒光光譜以及形態(tài)分析Fig. 1 UV-vis absorption spectra, fluorescence emission spectra and size distribution of CQDs from scallop

圖 2 扇貝來(lái)源CQDs的結(jié)晶度、熒光壽命、表面官能團(tuán)及分子質(zhì)量分析Fig. 2 Crystallinity, fluorescence lifetime, surface functional groups and molecular mass analysis of CQDs from scallop

通過(guò)XRD考察扇貝來(lái)源CQDs的結(jié)晶狀態(tài)，如圖2A所示，在2θ為23.36°處觀(guān)察到一個(gè)較寬的衍射峰，這表明蝦夷扇貝中CQDs為無(wú)序的碳結(jié)構(gòu)，這與大多數(shù)CQDs的結(jié)晶度結(jié)果一致[25]。在室溫下通過(guò)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定CQDs的熒光衰減曲線(xiàn)，如圖2B所示。采用雙指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合計(jì)算得到蝦夷扇貝中CQDs的平均熒光壽命為5.98 ns。通過(guò)FTIR考察CQDs的表面基團(tuán)，由圖2C可知，CQDs在3 300 cm-1附近有明顯的吸收帶，這與氨基和羥基的伸縮振動(dòng)有關(guān)；位于2 900 cm-1處的吸收峰與C-H鍵振動(dòng)有關(guān)，這說(shuō)明CQDs表面存在甲基；1 641、1 522 cm-1和1 449 cm-1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)酰胺I、II和III帶。酰胺I帶主要由C＝O鍵的伸縮振動(dòng)引起，酰胺II帶與N-H彎曲振動(dòng)密切相關(guān)，酰胺III帶反映C-N拉伸振動(dòng)。FTIR結(jié)果表明，蝦夷扇貝中CQDs表面具有羥基、氨基、羧基和甲基等官能團(tuán)[26]。采用MALDI-TOF-MS測(cè)定蝦夷扇貝中CQDs的分子質(zhì)量，由圖2D可知，CQDs在m/z800～1 800范圍內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)離子峰，這表明CQDs存在不同分子質(zhì)量。此外，TEM圖像及粒徑分析結(jié)果均表明，蝦夷扇貝中CQDs粒徑不同，粒徑不同必然導(dǎo)致分子質(zhì)量的差異，這進(jìn)一步印證了MALDI-TOF-MS的結(jié)果。CQDs在m/z1 030處的離子峰強(qiáng)度最大，因此，以m/z1 030代表蝦夷扇貝中CQDs的分子質(zhì)量，這一結(jié)果與之前報(bào)道的烤雞肉和鴨肉中CQDs的分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果[8,27]相似。

圖 3 扇貝來(lái)源CQDs的元素組成分析Fig. 3 Elemental analysis of CQDs from scallop

采用XPS進(jìn)一步表征扇貝來(lái)源CQDs的元素組成和表面基團(tuán)。由圖3A可知，蝦夷扇貝中CQDs XPS全掃描譜中存在3 個(gè)主要峰，結(jié)合能分別為285、399 eV和532 eV，分別對(duì)應(yīng)C、N和O 3 種元素。根據(jù)峰面積計(jì)算得到CQDs中C、N和O 3 種元素的相對(duì)含量分別為23.75%、7.01%和68.77%。相對(duì)較高的N元素含量表明蝦夷扇貝中的含氮成分（如蛋白質(zhì)）參與了CQDs的形成。圖3B～D分別是C1s、N1s和O1s的XPS高分辨譜圖。XPS高分辨譜圖可以展現(xiàn)CQDs表面基團(tuán)信息。在C1s XPS高分辨譜圖中284.7、286.0、286.7 eV和288.0 eV 4 個(gè)峰分別表示C-C/C＝C、C-N、C-O和O-C＝O鍵。N1s XPS高分辨譜圖存在398.1 eV和398.6 eV兩個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)吡啶氮和N-H基團(tuán)。O1s XPS高分辨譜圖在531.3 eV和532.3 eV分別存在O-C＝O和C-O兩個(gè)特征峰[25-26,28]。這與FTIR結(jié)果類(lèi)似，XPS分析結(jié)果進(jìn)一步證明了蝦夷扇貝CQDs存在羥基、氨基和羧基等官能團(tuán)。

2.2 扇貝來(lái)源CQDs與Cd2+的相互作用

圖 4 扇貝來(lái)源CQDs與Cd2＋的ITC分析Fig. 4 ITC analysis of CQDs and Cd2+ from scallop

ITC 是研究物質(zhì)之間相互作用的有效手段，可以通過(guò)測(cè)定物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的熱力學(xué)變化，揭示2 種物質(zhì)之間的結(jié)合力以及結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)。熱力學(xué)參數(shù)包括ΔG、ΔH和ΔS，它們?cè)谖镔|(zhì)相互作用時(shí)不同的變化規(guī)律可以闡釋物質(zhì)相互作用的機(jī)制。一般來(lái)講，分子間相互作用力主要分為4 種類(lèi)型：氫鍵、范德華力、靜電相互作用和疏水相互作用。當(dāng)氫鍵或范德華力為分子間主要相互作用力時(shí)，ΔS＜0且ΔH＜0；當(dāng)分子間作用力主要為靜電相互作用時(shí)，ΔH＜0而ΔS＞0；當(dāng)疏水相互作用為主要作用力時(shí)，ΔS＞0且ΔH＞0[13,29]。圖4A為Cd2+滴定蝦夷扇貝中CQDs的ITC曲線(xiàn)，圖4B為每次滴定結(jié)合后產(chǎn)生的熱圖。Cd2+滴定CQDs后吸熱不斷下降，校正因Cd2+滴定稀釋而導(dǎo)致的溶解熱后，采用非線(xiàn)性最小二乘法模型擬合，以獨(dú)立位點(diǎn)結(jié)合模型確定Cd2+與CQDs相互作用過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)。Cd2+與CQDs相互作用過(guò)程中的ΔG為-27.24 kJ/mol，ΔG＜0說(shuō)明兩者之間的反應(yīng)為自發(fā)反應(yīng)。同時(shí)，該過(guò)程中ΔH為-4.869 kJ/mol，ΔS為75.04 J/（mol·K），說(shuō)明Cd2+與CQDs結(jié)合力主要為靜電相互作用。Cd2+與CQDs相互作用的Ka為5.925×104mol/L，n為0.408，說(shuō)明Cd2+與CQDs具有良好的結(jié)合力。綜上所述，Cd2+可以通過(guò)靜電相互作用自發(fā)地與CQDs形成CQDs-Cd2+復(fù)合物。

2.3 扇貝來(lái)源CQDs及CQDs-Cd2+的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

食源性CQDs廣泛存在于食品中，雖然碳本身不被認(rèn)為是有毒元素，但CQDs因具有較小尺寸，可能對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)，其安全性受到廣泛關(guān)注[30]。多數(shù)研究結(jié)果表明，食源性CQDs的毒性較小。如以2 g/kgmb劑量灌胃可樂(lè)中的CQDs，對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)沒(méi)有顯著影響[31]。Liao Han等[32]研究飲料中CQDs對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，當(dāng)CQDs質(zhì)量濃度低于20 mg/mL時(shí)，不會(huì)引起細(xì)胞活性的顯著下降。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法評(píng)價(jià)扇貝來(lái)源CQDs對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性，由圖5A可知，隨著CQDs質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，當(dāng)CQDs質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率接近60%，當(dāng)CQDs質(zhì)量濃度小于0.12 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率受到CQDs的影響較小。

圖 5 CQDs及CQDs-Cd2＋對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig. 5 Cytotoxicity analysis of CQDs and CQDs-Cd2+ complex

一般而言，納米顆粒因相對(duì)比表面積較大，且表面自由能較高，能夠與其他分子通過(guò)疏水相互作用、氫鍵和靜電吸附等發(fā)生相互作用。ITC結(jié)果表明，扇貝來(lái)源CQDs能夠通過(guò)靜電相互作用與Cd2+形成復(fù)合物，這種復(fù)合物的細(xì)胞毒性尚不清楚。為進(jìn)一步研究食源性CQDs對(duì)鎘毒性的影響，測(cè)定當(dāng)CQDs存在時(shí)對(duì)Cd2+誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的影響。由圖5B可知，CQDs的存在增強(qiáng)了Cd2+的毒性，細(xì)胞存活率隨CQDs質(zhì)量濃度增加而下降。當(dāng)Cd2+（10 μmol/L）單獨(dú)存在時(shí)，細(xì)胞存活率為52.2%，在此條件下，加入0.06 mg/mL CQDs后，細(xì)胞存活率下降到45.1%，當(dāng)加入CQDs質(zhì)量濃度增加到0.12 mg/mL后，細(xì)胞存活率下降到39.6%。為排除CQDs自身毒性對(duì)細(xì)胞活性的影響，同時(shí)測(cè)定CQDs單獨(dú)存在時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的影響。CQDs質(zhì)量濃度0.06 mg/mL和0.12 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率分別為96.4%和90.5%。細(xì)胞存活率下降幅度低于與Cd2+共同存在時(shí)，這表明CQDs強(qiáng)化了Cd2+的毒性。越來(lái)越多的研究表明，Cd2+會(huì)破壞細(xì)胞線(xiàn)粒體膜的完整性，可通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33-34]。進(jìn)一步測(cè)定CQDs存在情況下Cd2+對(duì)細(xì)胞ROS水平（圖5C）和線(xiàn)粒體膜電位（圖5D）的影響。結(jié)果表明，CQDs存在情況下，與僅存在Cd2+相比，細(xì)胞ROS水平大幅升高；同時(shí)，線(xiàn)粒體膜電位結(jié)果表明CQDs與Cd2+共同存在產(chǎn)生的聯(lián)合毒性對(duì)線(xiàn)粒體膜完整性影響更大；表明CQDs可能通過(guò)增加ROS水平和損害線(xiàn)粒體功能增強(qiáng)Cd2+毒性。

圖 6 CQDs及CQDs-Cd2＋復(fù)合物對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig. 6 Effect of CQDs and CQDs-Cd2+ complex on cell cycle

細(xì)胞周期分為2 個(gè)階段，分別為細(xì)胞間期與細(xì)胞分裂期，包括細(xì)胞一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束整個(gè)過(guò)程，其中，細(xì)胞間期又分為3 個(gè)階段，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞周期停滯是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[35]，細(xì)胞周期受到嚴(yán)密調(diào)控，基因組DNA完成復(fù)制并均等分配到子細(xì)胞中。當(dāng)處于不利條件時(shí)，細(xì)胞分裂停止，甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡。處于細(xì)胞周期不同階段DNA含量不同，G1期細(xì)胞具有二倍體細(xì)胞的DNA含量（2N），G2期因DNA復(fù)制，細(xì)胞中DNA含量翻倍（4N），S期細(xì)胞的DNA含量介于G1期和G2期之間。通過(guò)DNA含量不同，可以區(qū)分處于不同細(xì)胞周期階段的細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度可以直接反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)。由圖6可知，與對(duì)照組相比，Cd2+孵育導(dǎo)致G1期細(xì)胞比例減少，從對(duì)照組的57.7%下降到51.8%；S期和G2期細(xì)胞比例增加，分別從對(duì)照組的27.7%和8.5%上升到36.2%和13.2%。這說(shuō)明細(xì)胞周期被阻滯在G2期。當(dāng)加入CQDs后，CQDs與Cd2+共同孵育會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的細(xì)胞周期阻滯。G2期細(xì)胞周期阻滯能夠?qū)е录?xì)胞凋亡，這與上述細(xì)胞活性結(jié)果相符。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了扇貝來(lái)源的C Q D s，結(jié)果表明，CQDs呈球形，在水溶液中分散良好，平均粒徑為3.7 nm。CQDs表面具有羥基、氨基和羧基等豐富的官能團(tuán)。ITC結(jié)果表明，CQDs與Cd2+通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物。進(jìn)一步評(píng)價(jià)CQDs對(duì)Cd2+細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果表明，CQDs增強(qiáng)了Cd2+的細(xì)胞毒性，干擾正常細(xì)胞周期。本研究系統(tǒng)表征了扇貝來(lái)源CQDs的性質(zhì)及其與重金屬離子的相互作用，為認(rèn)識(shí)食源性納米顆粒的性質(zhì)提供了參考。