和 友，王曉愛，潘曉賦，楊君興

(1.中國科學院 上海高等研究院 上海光源科學中心, 上海 201204; 2.中國科學院 昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室 云南省高原魚類育種重點實驗室, 云南 昆明 650223)

金線鲃屬是我國特有的鯉科魚類，分布于我國西南喀斯特地區(qū)地下暗河及與之相連的水體中.至今已有超過60種金線鲃魚類被報道[1].分子系統(tǒng)發(fā)育研究顯示：金線鲃屬與鯽屬、鯉屬、原鯉屬、須鯽屬、似鱤屬構成一個單系群[2].該屬魚類中一半為典型洞穴魚類，表現(xiàn)出視覺退化、體色白化等表型，其基因組和轉錄組水平變化機制不同于國際上所用的脂鯉科洞穴魚墨西哥麗脂鯉[3-5]，是研究退行性演化的新模型.頭部結構是魚類比較解剖學研究的重要內容之一[6]: 一方面頭部是全身骨骼最復雜組合之處，包含了豐富的分類與進化信息；另一方面，對頭部所在的眼、嗅囊、內耳等感覺器官以及腦的比較解剖有助于認識其對洞穴環(huán)境的感覺適應.二十世紀八九十年代，我國學者曾對當時已知的少數(shù)金線鲃物種的體鱗形態(tài)、圍眶骨系等特征進行過描述[7-9]，但對金線鲃魚類的腦結構的研究迄今尚未見報道.滇池金線鲃是金線鲃屬魚類的旗艦物種，其全基因組測序已經(jīng)完成[4]，并已成功實現(xiàn)人工繁殖[10].滇池金線鲃具有正常發(fā)育的眼，對其腦結構的研究，可作為該屬魚類神經(jīng)系統(tǒng)比較解剖的基礎.作者基于同步輻射顯微CT方法對金線鲃顱腦結構開展了3維無損研究，獲得相關物種頭部骨骼、腦大體形態(tài)、耳石結構等信息[4,11].新近，利用顯微光學切片斷層成像(Micro-Optical Sectioning Tomography, MOST)技術，我們完成了一套基于Nissl染色的滇池金線鲃亞微米分辨率的3維腦圖譜，為開展金線鲃屬魚類的腦結構和功能研究提供了一套比對標準.

本文對滇池金線鲃中腦視頂蓋結構進行報道.視頂蓋是硬骨魚類中腦背側的一對顯著的解剖結構(又稱作視葉)，是重要的視覺中樞，主要接受對側視神經(jīng)的纖維投射，具有明顯的分層結構(lamination).顯微光學切片斷層成像以1μm步長對染色后的腦進行自動連續(xù)切片和圖像采集，通過高精度配準后獲取亞微米精度的全腦3維圖譜.我們基于MOST技術對Nissl染色的滇池金線鲃視頂蓋3維復原后進行組織學觀察，并參照鯽魚視頂蓋Bodian(蛋白銀)染色結果[12]識別其分層結構，探討了相關的解剖學名詞，為后繼相關腦區(qū)的功能與演化研究提供解剖學基礎.

1 材料與方法

云南省高原魚類育種重點實驗室人工繁殖兩年齡滇池金線鲃，全長10～12cm.丁香油麻醉后，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛(PFA)溶液中4℃過夜后，重新更換4%PFA保存8月以上.隨后進行增強型Nissl染色，由中國科學院上海藥物研究所MOST及圖像融合分析平臺完成顯微光學切片斷層成像.魚腦置于2.5%硫堇染液中染色12d，再用70%的乙醇浸泡4d脫色.隨后用梯度乙醇、乙醇-丙酮(體積比1∶1)溶液、100%丙酮各浸泡2h脫水，在新的100%丙酮中過夜.將脫水后的魚腦依次浸入50%、75%的Spurr樹脂中滲透，最后在100%Spurr樹脂中滲透3d，60℃烘箱內加熱聚合36h后包埋.包埋后樣品裝MOST組織切片機，以1μm切片厚度和20×鏡頭條件下進行連續(xù)自動切片與圖像采集；單張圖像以8位jpg格式保存.所獲取全套圖像(image stack)導入AVIZO軟件中分析觀察；8位灰度圖像反相處理后以藍綠色調渲染觀察；體積元素(Volume Pixel)大小為0.35μm×0.35μm×1μm.

2 結 果

通過顯微光學切片斷層成像，我們獲取了一套滇池金線鲃的自端腦至菱腦(小腦與延腦)的腦圖譜(圖1).滇池金線鲃中腦解剖結構與其他鯉科魚類大體相同：背側為一對視葉(即視頂蓋)，腹側中腦被間腦下葉遮擋；中腦嘴端與間腦交界處通過后聯(lián)合相區(qū)分；中腦本身分為背部與腹部，背部為一對視頂蓋(tectum opticum)，腹部為中腦被蓋(tegmentum)；左右視頂蓋中線結合處下方為一對縱枕；視頂蓋與被蓋間具有左右腦室(tectal ventricle)；中腦尾端小腦瓣伸入視頂蓋與被蓋之間(圖2).

圖1 滇池金線鲃Nissl染色腦橫切片

視頂蓋從前到后覆蓋整個中腦.我們選取中后段位置、背內側部位的視頂蓋進行觀察(圖2).經(jīng)過3維重建后，可清晰辨別5條神經(jīng)元胞體的聚集帶(圖2(b)，圖3).我們以此為依據(jù)，并通過與文獻報道的鯽魚視頂蓋Bodian染色結果進行比對[12]，將滇池金線鲃視頂蓋由內向外劃分為: 圍腦室層(Stratum Periventriculare, SPV)、中央白質層(Stratum Album Central, SAC)、中央灰質層(Stratum Griseum Central, SGC)、表面灰質與纖維層(Stratum Fibrosum et Griseum Superficiale, SFGS)、邊緣層(Stratum Marginale, SM).各層簡介如下.

圖2 (a)中腦后部經(jīng)視頂蓋、小腦瓣、被蓋、下葉的3維復原斷層(50μm厚,標尺: 1mm),(b)自(a)中ROI區(qū)域視頂蓋3維復原(標尺: 150μm).

1)圍腦室層(SPV): 此層位于視頂蓋最內側，與側腦室相鄰.由大約6排圓形神經(jīng)元胞體緊密排列而成.Nissl染色組織切片上也極易識別(圖3(c)).

圖3 滇池金線鲃視頂蓋分層(自圖2(b)中ROI區(qū)域)

2)中央白質層(SAC): 此層最薄.其內側與圍腦室層相接，外側邊界由一層神經(jīng)元胞體聚集帶界定.該層神經(jīng)元中有較大的錐體神經(jīng)元和中等大小梭形細胞.在鯽魚視頂蓋Bodian染色結果中[12]，此層為視頂蓋傳出纖維所在的區(qū)域.

3)中央灰質層(SGC): 此層最厚，包含兩層細胞聚集帶.內側神經(jīng)元胞體聚集帶位于此層中部，外側神經(jīng)元胞體聚集帶形成本層的外側邊界，因此該層可分為內、外兩部分.

4)表面灰質與纖維層(SFGS): 此層內側與中央灰質層相接，外側以整個視頂蓋中最外側神經(jīng)元胞體聚集帶為邊界.在鯽魚視頂蓋Bodian染色結果中[12]，此層為接受對側視神經(jīng)纖維傳入的主要部位.

5)邊緣層(SM): 此層神經(jīng)元胞體十分稀少.在鯽魚視頂蓋Bodian染色結果中[12]，此層含有大量無髓鞘神經(jīng)纖維.

3 討 論

3.1 滇池金線鲃視頂蓋的分層

中腦視頂蓋是魚類的重要視覺中樞，主要接受對側視神經(jīng)的纖維投射.在輻鰭魚類各代表類群研究中，通過Golgi染色等重金屬染色、結合逆行性追蹤，顯示視頂蓋都具有明顯分層結構[12-13].Vanegas等[14]將銀鱸單側眼球摘除后，結合硝酸鈾酰重金屬染色，將對側視頂蓋(即摘除眼球的視神經(jīng)投射側)由內向外分為6層(stratum)(表1Ⅱ).而同側視頂蓋中(未摘除眼球的視神經(jīng)投射側)由于不存在退行性神經(jīng)纖維標記，其分層結構除可識別出SPV、SAC兩層外，其余各層界限并不明顯.Von Bartheld等[15]基于辣根過氧化物酶(HRP)追蹤標記視神經(jīng)對輻鰭魚類各代表類群的視頂蓋比較研究中沿用Vanegas的6層分層模式.其結果表明視神經(jīng)的主要投射部位為SFGS層，這是所有魚類接受視神經(jīng)投射的保守區(qū)域.同時不同類群的視頂蓋分層存在差別，主要在于: 1)是否存在單獨的視覺層(Stratum Opticum, SO); 2)SGC層是否接受視神經(jīng)投射.對于鯉科魚類而言，基于HRP的追蹤標記實驗中SO層與SFGS層的界限不明顯[15].而Northcutt基于Bodian蛋白銀染色對輻鰭魚類視頂蓋分層的研究結果與此一致[12].他將視頂蓋由內向外先分為4區(qū)(zone): PGZ、DWZ、CZ、SGWZ(表1Ⅰ)；各區(qū)下再以阿拉伯數(shù)字分“帶(layer)”(由于中文“層”已經(jīng)用于“stratum”，我們將“l(fā)ayer”翻譯為“帶”，以免混淆).PGZ區(qū)相當于SPV層，DWZ區(qū)相當于SAC層、CZ區(qū)相當于SGC層，而SGWZ區(qū)則對應SFGS、SO、SM 3層.這樣4分區(qū)的分層結構在所有輻鰭魚類中是保守的，而對不同類群則可再以“帶(layer)”進行細致劃分.

表1 視頂蓋分層名詞

Nissl染色(及HE曙紅染色)主要對神經(jīng)元胞體進行著色，但無法對神經(jīng)纖維著色，因此在傳統(tǒng)Nissl染色的腦組織切片中，無法準確區(qū)分視頂蓋中除SPV，SM層外的分層結構界限.本文通過MOST方法獲取了基于Nissl染色的滇池金線鲃三維腦圖譜.通過3維復原的視頂蓋，可以清晰辨別出5條神經(jīng)元胞體聚集帶(圖3(a)).我們以此為依據(jù)，并參照鯽魚Bodian染色結果[12]，識別出滇池金線鲃視頂蓋5層結構(圖3)(表1Ⅴ)，SAC、SGC、SFGS 3層外側邊界由對應的神經(jīng)元胞體聚集帶清晰界定.SFGS層與SM層分界明顯，但在SFGS層內神經(jīng)元胞體連續(xù)分布，無法進一步區(qū)分出一個單獨的SO層；這與基于Bodian蛋白銀染色和HRP逆向追蹤的鯽魚視頂蓋分層研究相一致[12,15].

在滇池金線鲃視頂蓋各層中SGC層最厚，根據(jù)該層中部的神經(jīng)元胞體聚集帶3(圖3(a))又可將SGC層分為內外兩部分，外側部分相當于銀鱸視頂蓋中的內網(wǎng)狀層(Inner Plexiform Layer, IPL)[16].將3維復原圖與對應Nissl染色組織切片圖配準后，各分層結構清晰可見(圖3(b)).而與之形成明顯對比，在Nissl染色組織切片中，除內外兩側的SPV、SM層外，其他SAC、SGC、SFGS各層邊界很難界定(圖3(c)).

3.2 解剖學名詞

現(xiàn)在，國際上基于Vanegas等的6分層結構在魚類視頂蓋的比較解剖和相關功能研究中被廣泛接受，但早期不同研究者對視頂蓋分層采用名詞各不相同[12].國內對硬骨魚類的視頂蓋組織學研究，主要見于鯉魚[17]、真鯛[18]、羅非魚[19]、貝氏高原鰍[20]、寬體沙鰍[21]等.所用中文名詞各有差別.秉志基于Cajal染色并參照文獻[22]，將鯉魚視頂蓋分為8層[17]，第1～4層分別為室管膜與視蓋深層纖維、結層、視蓋聯(lián)合層、視蓋臂纖維層；第7層為外結層，第8層為視神經(jīng)層；第5、6層未給出名稱.其分層依據(jù)和所用解剖學名詞，無論中英文至今已有較大變化.上世紀90年代國內研究者相繼對其他硬骨魚類視頂蓋組織學進行了研究，對分層結構所用的中文名稱有所不同，但外文詞源(包括本研究)都來自前述Vanegas等的工作[14,16].王藝磊等[18]基于Golgi染色并依循Vanegas等(1974)對鱸形目魚類的研究[16]，將真鯛視頂蓋分為6層，中文名稱由內向外分別為: 圍腦室層(SPV)、中央白質層(SAC)、中央灰質層(SGC)、表面灰質及纖維層(SFGS)(原文中“灰質”打印為“灰管”)、視覺層(SO)、邊緣層(SM)(表1Ⅲ).黃靜等[20]在對貝氏高原鰍中腦視頂蓋進行Nissl染色/HE染色組織學研究時，給出的分層結構中文名依次為: 圍腦室層(SPV)、中央纖維層(SAC)、中央細胞層(SGC)、表面纖維層(SFGS)、視神經(jīng)層(SO)、邊緣層(SM)(表1Ⅳ).陳蓉等[19]基于HE染色對羅非魚的研究、史晉絨等[21]基于Nissl染色/HE染色對寬體沙鰍的研究所采用的名稱與此相同.

如上節(jié)所述，由于Nissl染色(和HE染色)無法對神經(jīng)纖維著色，因此在基于Nissl染色標本中無法觀察到神經(jīng)纖維(圖3(c))；若將視頂蓋6分層結構表述為“神經(jīng)纖維與細胞層交替排列的層狀結構”則并不準確.遵循Vanegas等原始文字[14]，本文中采用“中央灰質層”代替“中央細胞層”來翻譯“Stratum Greiseum Centrale”，采用“表面灰質與纖維層”代替“表面纖維層”來翻譯“Stratum Fibrosum et Greiseum Superficiale”(表1Ⅴ).同時需要指出的是：盡管魚類視頂蓋中具有“視覺層(SO)”，但SO層并不是在所有魚類中均可區(qū)分，而“表面灰質與纖維層(SFGS)”是視神經(jīng)纖維投射的主要部位[15].此外，本文中采用“區(qū)”、“層”、“帶”翻譯視頂蓋研究中相應的“zone”、“stratum”、“l(fā)ayer”3級結構.

致謝:顯微光學切片斷層成像由中國科學院上海藥物研究所MOST及圖像融合分析平臺完成，特此致謝.